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大鼠胰腺移植模型制作
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胰腺移植是目前临床上有效治疗I型糖尿病，挽救II型糖尿病晚期伴肾功能不全的外科手段，因此，胰腺移植一直受到广泛的关注，至今围绕着胰腺移植，仍有许多问题需要解决，这些问题的基础研究都需要在合适的动物模型上进行，其中大鼠因为其成本低，来源易，免疫系统与人类相似等优点，是目前器官移植领域流行的实验动物之一。但是大鼠胰腺移植模型的建立是一个难度很大的实验外科技术，操作复杂，成功率低。因此，需要建立一种比较规范，操作简便，模型稳定且成功率高的胰腺移植模型的方法，以利于进行胰腺移植的基础研究。 一、 手术器械 显微外科手术器械包，手术显微镜1台，自制S拉钩（用橡皮筋一端带上弯成S形的大头针）4个，眼科剪1把，其它外科器械若干及纱布、棉球、棉片和橡皮条等。 二、 供、受者大鼠的选择 根据不同的研究目的选择不同的动物品系，在同种移植模型中，一般采用两种纯系健康大鼠，如Lewis大鼠，Brown Norway 大鼠（BN），DA大鼠等，国内应用Wistar，SD大鼠也比较多。其中受者大鼠于移植手术前制备成糖尿病模型 三、大鼠糖尿病模型的建立 1、10%的四氧嘧啶按100mg/kg的剂量连续两天于大鼠腹股沟区皮下注射，隔日测定血糖，一周后血糖持续>16.7mmol/L者，作为合格的糖尿病受者大鼠。 2、采用70mg/kg肌肉注射链脲霉素，以尿糖定性强阳性，非禁食血糖>20mmol/L持续10天者为稳定的糖尿病模型。 3、受者鼠一次性静脉注射链脲霉素55mg/kg，第7d开始测定非禁食血糖，若血糖浓度连续3d超过22mmol/L，判定为大鼠糖尿病诱导成功。 四、术前准备及麻醉方式 术前供者禁食24h，饮用50g/L葡萄糖生理盐水，受者禁食24h，饮用25g/L葡萄糖生理盐水，供、受者麻醉均采用1%的戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，麻醉过浅时加乙醚吸入辅助。 五、供胰切取术 麻醉成功后，经腹正中切口进腹，（1）将胃向上翻起，结扎切断胰腺和大网膜之间的血管联系及胃网膜左右动静脉，结扎十二指肠近端，切断幽门，在食管与胃交界出结扎切断胃左血管、食管，结扎切断胃短动脉并切除全胃；（2）胰腺下缘自脾脏向胰头方向游离胰腺，保留胰管入十二指肠管约1.5cm，结扎切断肠系膜上血管；（3）结扎切断胆总管及肝固有动脉，游离门静脉至入肝门分叉处；（4）打开腹主动脉前被覆的后腹膜，结扎切断左右肾及肾上腺动脉，完全游离腹腔动脉和肠系膜上动脉所在的腹主动脉段，经阴茎背静脉注入肝素（25U/L）生理盐水；（5）分别结扎肠系膜上动脉开口以下和腹腔动脉开口以上的腹主动脉，肠系膜上动脉开口以下腹主动脉插管，予以4℃ Euro Collins液（或者4℃平衡液25U/L肝素溶液）灌洗移植物，同时横断门静脉，灌洗至门静脉断端流出液转清，移植物颜色由淡红变为苍白；（6）灌洗完成后，完整地切取移植物及脾脏，移植物置4℃Euro Collins液中保存。 六、供胰植入术 （一） 腔静脉-膀胱引流式胰腺移植 下腹正中切口进腹，用生理盐水纱布将肠管推向上方，膀胱、精囊腺推向下方并以拉钩固定，游离髂血管分叉上方1.5cm左右的腹主动脉及下腔静脉，经阴茎背静脉注射肝素（25IU/L）至全身肝素化，血管夹阻断游离血管上下端，9-0无创显微缝线作供者门静脉与受者下腔静脉连续端-侧吻合，8-0无创显微缝线作供者腹主动脉与受者腹主动脉连续端-侧吻合。吻合过程中移动胰腺时，牵动与移植胰腺相连脾脏，避免直接钳夹移植胰。吻合口及供者腹主动脉表面可以涂少量的ZT胶，以封闭吻合口缝隙和腹主动脉营养血管，切除移植物附带的脾脏，先远心端再近心端松开血管夹，恢复移植胰血供。 将供者十二指肠段与受者膀胱顶部行侧-侧吻合（3-0丝线单层连续缝合），吻合口大约0.5cm，大网膜覆盖移植物，关腹结束手术。 （二）门静脉-肠道引流式胰腺移植 腹正中切口入腹，打开腹腔，在左肾静脉以下，分离出腹主动脉，用改良过的李氏钳纵行夹住该段动脉，纵行切开动脉闭，用含肝素的平衡盐溶液冲洗管腔，在低位分离肠系膜上静脉，近端用微血管夹夹住，远端用3-0丝线结扎，在同一水平高度同时结扎肠系膜上动脉。紧靠丝线结扎处切断肠系膜上静脉，管腔同样用含肝素的平衡盐溶液冲洗，切断缺血的小肠及回盲部（30~40%），用7-0尼龙线将两断端行端-端全层肠吻合，将移植物从冰水中移出，用带冰屑的湿纱布覆盖移植物。先行静脉缝合，应确保静脉吻合后无扭转，供者门静脉与受者肠系膜上静脉以10-0无损伤显微缝线端-端间断缝合，在缝合过程中，用生理盐水灌洗静脉腔，并轻轻地用显微钳分离血管边缘，避免吻合口狭窄。供胰腺的腹主动脉与受者的腹主动脉以9-0无损伤显微缝合线行端-侧连续缝合。吻合完毕后先松开静脉夹，再松开动脉夹，用干明胶海绵轻压动脉吻合口1~2min。最后，供胰的十二指肠开口一端与受者近端空肠行端-侧吻合，另一端结扎。切除供胰上附着的脾脏，关腹结束手术。 七、术后监测和处理 根据实验研究设计的需要监测移植胰功能，如果移植胰功能正常，在发生排斥反应以前空腹血糖值正常，C-肽值正常。 术后注意受者动物保温，可以置于电热毯上，以电灯热辐射24h。一般情况下，动物于术后1h内从麻醉中苏醒。术后每天皮下注射含25g/L葡萄糖和4.5g/L氯化钠的糖盐水30~40ml（内含150mg氧哌嗪青霉素），36~48h视动物情况开始正常饮食。 |
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