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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠pcr问题求大侠赐教
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小冀-

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【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by yakun123 at 2016-11-14 10:21:47
是浓度比为1比1吗？我们实验室的手册上讲加入的500bp的片段为0.05-5ng ，能说明下是按照质量比还是浓度比，另外bp数目不同，加入的量相同吗？
...

不一样的，一般基因组200，质粒小于50

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11楼2016-11-14 11:11:03
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
额。反正你可以考虑先来两个片段和一起。这样成功率高一点，一步步来

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12楼2016-11-14 12:25:48
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choujiaoqi

铁杆木虫 (知名作家)
加入的模板量，可以参考下其他人的，这个我不太记得了

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13楼2016-11-14 12:27:34
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yakun123

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 小冀- at 2016-11-14 11:11:03
不一样的，一般基因组200，质粒小于50
...

实验手册上说的是50微体系加多少ng不是指浓度
重叠pcr问题求大侠赐教



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14楼2016-11-14 15:57:56
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yakun123

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by choujiaoqi at 2016-11-14 12:27:34
加入的模板量，可以参考下其他人的，这个我不太记得了

好的 谢谢啦

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15楼2016-11-14 16:03:54
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小冀-

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【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by yakun123 at 2016-11-14 15:57:56
实验手册上说的是50微体系加多少ng不是指浓度

...

多少ng是加之前算的，选定一定的质量，然后计算加入的体积

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16楼2016-11-14 16:22:32
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yakun123

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 小冀- at 2016-11-14 16:22:32
多少ng是加之前算的，选定一定的质量，然后计算加入的体积
...

师兄是按照这个公式计算的，你看下
用浓度初以bp数的道理是什么？
我的想法是 两段都加入3ng.根据浓度计算体积就行了。片段的bp数目不同有啥影响
重叠pcr问题求大侠赐教-1



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17楼2016-11-14 22:17:33
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小冀-

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【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by yakun123 at 2016-11-14 22:17:33
师兄是按照这个公式计算的，你看下
用浓度初以bp数的道理是什么？
我的想法是 两段都加入3ng.根据浓度计算体积就行了。片段的bp数目不同有啥影响

...

bp数不同影响摩尔比，这么计算没问题的

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18楼2016-11-14 22:21:29
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yakun123 at 2016-11-14 10:21:47
是浓度比为1比1吗？我们实验室的手册上讲加入的500bp的片段为0.05-5ng ，能说明下是按照质量比还是浓度比，另外bp数目不同，加入的量相同吗？
...

公式ug=（bp×pmol×660）/1000000，一个50ul的pcr反应体系一般加引物10pmol左右，带入之后500bp大概就是5ng的样子。重叠pcr前面几个循环就是把片段当引物的，两步法退火和延伸合并。

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19楼2016-11-14 23:36:55
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yakun123

铁虫 (小有名气)
两步法退火延伸理解了，给你我的数据，能给我讲一遍怎么算最后的加入量吗？片段500.1200.500bp 浓度89.141.50ng每微，根据你给的公式计算得3.3,7.92,3.3ng

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20楼2016-11-15 11:17:29
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