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重叠pcr问题求大侠赐教 已有1人参与
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我在做重叠pcr时，遇到了以下问题 1.mark跑出来不是很分散，可能是胶的问题，具体原因不是很清楚，麻烦讲下胶的注意事项 2.扩增杂带多，查资料讲可能是重叠互补的片段与两边的引物退火温度不一致，建议用特异性高的20bp序列作为重叠区，这样会增加引物长度，不会很贵吗？如果可以，大家会这样用吗？ 3.pcrw体系配制除了重组酶和buffer都是统一配置分装的，最后有2管没p出来，p出了6管.是我的操作不过关嘛 我做的是三段重叠，分别为500.1200.500bp.新手问题比较多，一样对重叠pcr注意事项讲详细点，谢谢大侠！ 发自小木虫Android客户端 |
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公式ug=（bp×pmol×660）/1000000，一个50ul的pcr反应体系一般加引物10pmol左右，带入之后500bp大概就是5ng的样子。重叠pcr前面几个循环就是把片段当引物的，两步法退火和延伸合并。 发自小木虫Android客户端 |
19楼2016-11-14 23:36:55
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补充下，我做的三段都做了纯化，然后按照师兄讲的用片段浓度除以片段长度算出后，定中片段为1微，算出上和下的体积，没有先做10个循环，直接将酶引物都放入做的pcr. 做了四次，第一次成功了，切胶回收没做对。失败了两次，都是没有目的条带，第四次有成功的也有没有的，杂带较多。确定引物酶都没问题 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-11-13 10:38:28
3楼2016-11-13 10:45:06
小冀-
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6楼2016-11-13 23:08:56
choujiaoqi
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1 胶的浓度是根据你的片段大小及目的用的。了解胶配置原理，你就知道哪里有问题了2引物如果是自己设计的话不贵，一个碱基才两块钱不到一个OD，公司设计的就贵了3扩增结果这个不好说，就算是 平均分配到六管有的没扩出来的因素也很多。比如 管子质量，机器加热槽分布不均匀，混合液没混匀等，都有可能，建议先一个个片段搞定，再去退火，而且每个片段纯化。还有片段多的话，可以分开链接，两个两个连，多了就不好了。 发自小木虫IOS客户端 |
7楼2016-11-13 23:17:52
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是浓度比为1比1吗？我们实验室的手册上讲加入的500bp的片段为0.05-5ng ，能说明下是按照质量比还是浓度比，另外bp数目不同，加入的量相同吗？ 发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-11-14 10:21:47
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胶的注意事项我了解了，我们配的是1%的胶，范围几百到一万之间，倒胶之前一定要完全冷却下来，不能太烫，另外倒的过程不能有气泡，一下倒成，不能在其快要凝固了再往里加。待其凝固大概20分钟，在含有EB的缓冲液浸泡30分钟。 公司设计的引物，所以自己加重叠区就不可行了。 先将p出的片段纯化，然后加入1.2片段，不加引物十个循环，再加1.4引物 p出后纯化，再加入3片段，十个循环，加1.6片段，我的理解对吗？另外加入的模板量怎么确定，楼上有人回答了 ，不太确定对不对，希望回答一下。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-11-14 10:29:42
10楼2016-11-14 10:30:57
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