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chase1024

木虫 (小有名气)

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[求助] 扩增基因引物上的酶切位点丢失问题已有1人参与

目的基因2600bp，上游引物59bp，下游引物30bp，均带有酶切位点，扩增基因连接pMD19(simple)，转化，菌落PCR验证，挑取阳性转化子送测序，测序结果显示只有目的基因（ATG开始，TAA结束），酶切位点均缺失，提取质粒酶切验证也不行，请问各位大神这是什么原因导致的？感激不尽。。。@biostar2009@wizardfan@youlinglyw

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1楼 2016-10-28 21:11:20

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kaobo2012

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-29 19:28:20

确实听说过，酶切、连接后，有一种情况是酶切位点会消失。但是具体是哪几个酶，就不记得了。你可以看看，酶切的保护碱基序列，是不是酶切必需的序列。如果是的话，连接后没有这个序列，酶切位点自然就消失了。

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2楼2016-10-28 22:35:10

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chase1024

木虫 (小有名气)

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chase1024: 回帖置顶 2016-10-29 00:03:33
kuaile5420: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-29 19:28:14

引用回帖:

2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-10-28 22:35:10
确实听说过，酶切、连接后，有一种情况是酶切位点会消失。但是具体是哪几个酶，就不记得了。你可以看看，酶切的保护碱基序列，是不是酶切必需的序列。如果是的话，连接后没有这个序列，酶切位点自然就消失了。

我是PCR产物直接连接T载的，没有进行酶切，引物上带的酶切位点就莫名其妙的消失了

发自小木虫Android客户端

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3楼2016-10-28 23:00:20

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