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百变迷糊

新虫 (初入文坛)

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专业: 土壤生态学

[求助] 求教各路大神土壤基因组的QPCR各种问题~

Sample Text
1、酶用的是Takara的RR420，预变性时间一直设置3min，师弟样品做出来质粒还不错，说明书上说30s，这个时间有关系吗？
今天刚设的程序设置错了10min，做出来的结果都是negative，没有ct值，是这个时间太长，酶失活的原因吗？但是这个酶是热启动的，温度高放了一会应该没事吧。
2、最近做的经常会显示negative，到底有哪些原因呢？
如下图1,1A 1B 1C 1D 1E是依次稀释十倍的质粒，最后三个浓度居然没有出来，质粒刚提出来的时候标线还不错的啊
而且这质粒好像峰形也不好看，不是单峰，
3、图1的溶解曲线是样品（1F）的，这个峰。。。是因为程序不适合吗，怎么调整呢？
还是土壤DNA实在浓度低，加上腐殖质各种的污染，试过把模板量加到5uL，效果也不是很明显。经常跑出来都是杂乱的，如最后一张图。
4、前段时间做的时候，质粒在92度出单峰，样品都在87度出峰，质粒浓度越低，峰就会慢慢转移到87度，这说明没有p出来吗？
（贴图上来的这次质粒温度又变成了84-87度之间。。。）
还是因为浓度低？产物跑胶发现高浓度的可以看到，（当然跑胶可能不是很敏感）
5、最后一张图的荧光值全是负的，而且负的那么大，又是什么鬼~
引物已经试过两种，都差不多的结果~
再做不出来，要疯啦~~