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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关双酶切问题，求助！！！
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MIDNA

铁虫 (小有名气)

[求助] 有关双酶切问题，求助！！！ 已有5人参与

我做了好几次酶切，但总没有切下来目的条带！是怎么回事啊？希望各位师兄师姐帮助解决！！！
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1楼 2016-10-08 16:17:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:50:32
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 21:50:37
如果双酶切切不开的话，可以分步酶切，如果还不行的话，考虑是不是酶不行，如果换了的话还是不行，就考虑是质粒的问题，可以向楼上说的那样测序

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···
8楼2016-10-08 23:11:37
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010308Jing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-10-08 22:16:32
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 21:50:44
有可能是buffer的问题，也有可能是模板本身的问题，可以把模板测个序，看看那两个酶切位点是不是在

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2楼2016-10-08 16:37:06
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普通回帖

MIDNA

铁虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:50:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-10-08 16:37:06
有可能是buffer的问题，也有可能是模板本身的问题，可以把模板测个序，看看那两个酶切位点是不是在

那两个酶切位点是确定在的啊，可就是切不下来？？
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3楼2016-10-08 16:44:26
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010308Jing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:50:54
xn8008: 应助指数+1 2016-10-10 21:51:15
你测过了吗？我们现在也遇到了这种情况，在addgene上买的，给我序列是有那两个酶切位点，但是切不动，现在只能去测序验证下

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4楼2016-10-08 16:48:22
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MIDNA

铁虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:51:19
引用回帖:
4楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-10-08 16:48:22
你测过了吗？我们现在也遇到了这种情况，在addgene上买的，给我序列是有那两个酶切位点，但是切不动，现在只能去测序验证下

好吧，谢谢师姐！
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5楼2016-10-08 17:04:59
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-10-08 22:16:55
你这个质粒是筛选的克隆么？如果是就两个原因吧，第一，克隆载体为阴性的，这个你可以用特异性引物或者通用引物来做个PCR验证，确定一下载体上面有没有目的条带，如果根本没有目的片段插入，你双酶切也是没有目的条带；第二，你的载体是有目的条带的，那么原因一方面可能是有些酶容易甲基化等一些修饰导致酶切位点失效，这个可以看看酶的说明书，如果是这样，可以换为载体上的其他酶，来进行验证。另一个原因或许就是你使用的酶有问题了，阔以尝试更换新酶试一下，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
6楼2016-10-08 18:22:11
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MIDNA

铁虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:52:52
引用回帖:
6楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-10-08 18:22:11
你这个质粒是筛选的克隆么？如果是就两个原因吧，第一，克隆载体为阴性的，这个你可以用特异性引物或者通用引物来做个PCR验证，确定一下载体上面有没有目的条带，如果根本没有目的片段插入，你双酶切也是没有目的条 ...

那请问师兄怎么做特异性引物PCR验证啊？由于刚学还请师兄多多指教！
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7楼2016-10-08 21:58:08
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tangbowen

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:52:56
切下来的片段多大

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9楼2016-10-10 00:03:47
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-10 21:53:02
原因可能很多，你尽量多做对照，不知道你质粒检测了没有，测序要是没有问题就要考虑内切酶是不是有问题，有的酶最适温度不同，或者不能共用一个buffer,还有就是切下来的片段太少电泳看不见？那就还是酶效率的问题

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10楼2016-10-10 00:20:25
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