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Nigori

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[交流] 农杆菌感受态细胞制备实验已有1人参与

实验目的：

（1）用于建立农杆菌转化体系；

（2）用于农杆菌表达系统构建；

（3）用于农杆菌其他分子生物学研究。

实验方法原理：

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。

实验材料：

土壤农杆菌LBA4404菌株

试剂、试剂盒 YEB液体培养基酵母提取物牛肉膏蛋白胨蔗糖硫酸镁氯化钙利福平储液

仪器、耗材超净工作台恒温摇床冷冻高速离心机高压灭菌锅冰箱超低温冰柜分光光度计接种针试管离心管离心管冰浴微量进样器吸头

一、实验仪器、材料和试剂

1. 仪器

超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，-70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

2. 材料

土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株

3. 试剂

（1）YEB液体培养基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，pH7.0，高压灭菌。

（2）利福平（Rif）储液：50 mg/ml

（3）20 mM CaCl2，高压灭菌。

二、实验步骤

1. 挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3 ml的YEB液体培养基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振荡培养过夜。

2. 取过夜培养菌液1 ml接种于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5。

3. 取2 ml菌液，13 000 rpm，离心30 sec，弃上清。

4、加入1000 μl 20 mM CaCl2，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30 min。

5、13 000 rpm，离心30 sec，弃上清，置于冰上，加入500 μl预冷的20 mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24 hr内使用，或液氮中速冻1 min，置-70℃保存备用。

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