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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化实验一直不成功 找不到原因
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

[求助] 转化实验一直不成功 找不到原因 已有7人参与

本人目前在构建新的表达载体   用的载体是pET-17b  载体与目的基因双酶切之后连接  转化DH5α感受态细胞
长出单菌落后进行验证  然后再从这个DH5α中提取质粒  准备转化到表达菌BL21中   然后就在这一步转化出了问题  怎么都转不进去  转化后涂布的平板就是没有菌落生长  很是苦恼  已经做了好久了  老板见一直没有结果还不满意……

求大神支招  感激不尽！！
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1楼 2016-09-07 09:24:55
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
十四_14: 金币+2, ★有帮助, 那么问题后来解决了吗？ 2016-09-13 08:48:47
引用回帖:
6楼: Originally posted by 十四_14 at 2016-09-08 08:33:07
涂板菌液的量也做了不同的  20微升，50微升，100微升，500微升，哪个都没长…………我还拿空载做了对照  也没长  但是同时做的空载转DH5α的对照长了菌  难道我的感受态有问题？？可都是新买的...

这个不一定是感受太的问题，我师妹做的时候用了自己做的，买的，别人实验室的都用了，dh5a都长的糊了板了，bl21的却始终没长，也在郁闷中

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···
36楼2016-09-11 23:47:52
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tayifeita

木虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 22:02:58
从dh5a

发自小木虫Android客户端
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2楼2016-09-07 09:29:42
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tayifeita

木虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-09-07 18:48:21
从感受态细胞里面提取的质粒确定没问题了话，转化到表达菌的步骤这个体系每个实验室都比较成熟，一般不会出现大的问题，你可以考虑下把涂板子的菌浓度加高一点，这些如果没问题但还是不长菌的话，考虑下重组质粒设计方案的问题了。

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3楼2016-09-07 09:35:57
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更恋秋风

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-09-07 18:48:31
xn8008: 应助指数+1 2016-09-08 22:02:53
第一，你需要知道你们实验室的bl21的效率有多高，第二，如果偏低，可以自己尝试着借一些别人的感受态自己再制备一批（买的不一定很好用），第三，bl21效率本来就不高，不需要转比5a更多的质粒才能有更多阳性克隆

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4楼2016-09-07 09:38:02
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