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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化实验一直不成功 找不到原因
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十四_14

荣誉版主 (正式写手)

[求助] 转化实验一直不成功 找不到原因 已有7人参与

本人目前在构建新的表达载体   用的载体是pET-17b  载体与目的基因双酶切之后连接  转化DH5α感受态细胞
长出单菌落后进行验证  然后再从这个DH5α中提取质粒  准备转化到表达菌BL21中   然后就在这一步转化出了问题  怎么都转不进去  转化后涂布的平板就是没有菌落生长  很是苦恼  已经做了好久了  老板见一直没有结果还不满意……

求大神支招  感激不尽！！
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1楼 2016-09-07 09:24:55
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armigera

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-09-09 22:34:05
首先，你确定DH5alpha中提取的质粒没问题，这说明你前面的克隆做对了，不用考虑连接或者是载体的问题。其次，BL21表达感受态不能被转化，但对照组的DH5alpha没问题，说明是BL21出了问题。那么问题找到了。如果你确定这个是BL21或者你能弄到BL21的话，可以自己做感受态，步骤和制作DH5alpha一样，都是很传统的分子实验。如果弄不到菌株，你可以跟老板说，你的表达片段里有很多稀有氨基酸，BL21不能满足需要，需要更换其他菌株，能说通的话这事就成了。祝好运！

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27楼2016-09-09 01:58:15
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tayifeita

木虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-08 22:02:58
从dh5a

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2楼2016-09-07 09:29:42
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tayifeita

木虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。myprayer祝您科研顺利，文章多多。 2016-09-07 18:48:21
从感受态细胞里面提取的质粒确定没问题了话，转化到表达菌的步骤这个体系每个实验室都比较成熟，一般不会出现大的问题，你可以考虑下把涂板子的菌浓度加高一点，这些如果没问题但还是不长菌的话，考虑下重组质粒设计方案的问题了。

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3楼2016-09-07 09:35:57
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更恋秋风

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-09-07 18:48:31
xn8008: 应助指数+1 2016-09-08 22:02:53
第一，你需要知道你们实验室的bl21的效率有多高，第二，如果偏低，可以自己尝试着借一些别人的感受态自己再制备一批（买的不一定很好用），第三，bl21效率本来就不高，不需要转比5a更多的质粒才能有更多阳性克隆

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4楼2016-09-07 09:38:02
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