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无花草

新虫 (初入文坛)

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[求助] NcoI单酶切，连接不上已有5人参与

大家好，小弟最近在构建载体，想以pGEM-T通过NcoI单酶切构建一个中间载体。实验过程如下：目标片段1和片段2长度均为2.7kb，通过TA克隆到pGEM-T载体上，重组T载体分别命名为pGEM-T-P1和pGEM-T-P2。然后想通过pGEM-T-P1和pGEM-T-P2用NcoI单酶切构建pGEM-T-(P1+P2)，但是一直连接不上。

说明：pGEM-T载体自带一个NcoI酶切位点，片段1和片段2也各带一个NcoI酶切位点。pGEM-T-P1用NcoI单酶切得5.2kb+0.47kb(图 Lane 1)，pGEM-T-P2用NcoI单酶切得2.9kb+2.6kb(图 Lane 3)，用Lane 1的5.2kb与Lane 3的2.6kb构成pGEM-T-(P1+P2)。Lane 2和Lane 4未切质粒电泳对照。
连接片段和载体pmol比试过3:1, 5:1, 10:1和20:1(且载体的pmol数在0.02以上，10微升体系)，4度连接过夜或更长，载体有去磷酸化，同时以载体连接转化对照，长了2各斑（有背景值）。

从酶切电泳图可以看出，酶切是成功的。连接酶用的TAKARA的T4连接酶，同时（同批）做的TA克隆片段连接，后期转化是正常的，说明连接酶是没有问题的，同时大肠杆菌（DH5α）也是没有问题的（也用质粒转化做了对照）。那么可以肯定就是片段的问题了，不知道为什么就是连接不上（转化平板不长斑，或是只长了一两个，可能是背景值了-载体自连）？？？

问题：
1.因为T载体已经连了一个2.7kb的片段，用NcoI单酶切再要连一个2.6kb的片段，是因为T载体的容纳能力有限吗？因为长片段连接难度大吗？
2.需要效果更好的连接酶？
3.需要换其他株系的大肠杆菌？
4.单酶切的缘故以及NcoI这种末端导致不好连接？
请大家帮忙解答下小弟的疑惑，分析下失败可能存在的原因，并给出您宝贵的建议，谢谢，感激不尽！

2016-08-19 11 时 11 分[2016.8.18(1)]-2.jpg@youlinglyw@biostar2009

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分子片段连接已经有1人回复
表达载体的构建已经有17人回复

好好做实验，毕业找份好工作！

1楼 2016-09-05 11:48:28

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yuy111

银虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-16 07:59:43
无花草: 金币+3, ★★★★★最佳答案, Thank you for your kindness remind and advice 2016-10-13 10:56:53

The two inserts can be incoperated in construction by one step or by two steps. Anyhow, one enzyme digestion on insert and backbone cannot guarantee the inserts are right combination and in right direction. So chance of successful will be very small. No matter if the size of inset and backbone. Experiment design must be make sure each step is working and then can continue to the next. Otherwise it only waste money and time. Even money is not yours but it is your time .