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NcoI单酶切，连接不上 已有5人参与
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大家好，小弟最近在构建载体，想以pGEM-T通过NcoI单酶切构建一个中间载体。实验过程如下：目标片段1和片段2长度均为2.7kb，通过TA克隆到pGEM-T载体上，重组T载体分别命名为pGEM-T-P1和pGEM-T-P2。然后想通过pGEM-T-P1和pGEM-T-P2用NcoI单酶切构建pGEM-T-(P1+P2)，但是一直连接不上。 说明：pGEM-T载体自带一个NcoI酶切位点，片段1和片段2也各带一个NcoI酶切位点。pGEM-T-P1用NcoI单酶切得5.2kb+0.47kb(图 Lane 1)，pGEM-T-P2用NcoI单酶切得2.9kb+2.6kb(图 Lane 3)，用Lane 1的5.2kb与Lane 3的2.6kb构成pGEM-T-(P1+P2)。Lane 2和Lane 4未切质粒电泳对照。 连接片段和载体pmol比试过3:1, 5:1, 10:1和20:1(且载体的pmol数在0.02以上，10微升体系)，4度连接过夜或更长，载体有去磷酸化，同时以载体连接转化对照，长了2各斑（有背景值）。 从酶切电泳图可以看出，酶切是成功的。连接酶用的TAKARA的T4连接酶，同时（同批）做的TA克隆片段连接，后期转化是正常的，说明连接酶是没有问题的，同时大肠杆菌（DH5α）也是没有问题的（也用质粒转化做了对照）。那么可以肯定就是片段的问题了，不知道为什么就是连接不上（转化平板不长斑，或是只长了一两个，可能是背景值了-载体自连）？？？ 问题： 1.因为T载体已经连了一个2.7kb的片段，用NcoI单酶切再要连一个2.6kb的片段，是因为T载体的容纳能力有限吗？因为长片段连接难度大吗？ 2.需要效果更好的连接酶？ 3.需要换其他株系的大肠杆菌？ 4.单酶切的缘故以及NcoI这种末端导致不好连接？ 请大家帮忙解答下小弟的疑惑，分析下失败可能存在的原因，并给出您宝贵的建议，谢谢，感激不尽！  2016-08-19 11 时 11 分[2016.8.18(1)]-2.jpg@youlinglyw@biostar2009 |
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