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小木虫论坛-学术科研互动平台» 网络生活区» 有奖问答 » 有奖问答中转子版 » 溶液中蛋白质含量怎样测定？已解决！谢谢！
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yusen_1982

荣誉版主 (职业作家)

小木虫最高学位委员会主席
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
    考马斯亮兰法（Bradford法）
（一）实验原理
    双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
    1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
    考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
    在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
    Bradford法的突出优点是：
   （1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1g。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
   （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
   （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
    此法的缺点是：
   （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 —球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
   （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
   （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
    1. 试剂：
   （1）标准蛋白质溶液，用 —球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
   （2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
    2. 器材：
   （1）可见光分光光度计
   （2）旋涡混合器
   （3）试管16支
（三）操作方法
    1. 标准方法
   （1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
   （2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表格：

     管 号     1   2     3     4     5     6     7     8     9    10
  标准蛋白质   0  0.01   0.02   0.04  0.06  0.08   0.10
  (1.0mg/ml)
  未知蛋白质                                           0.02  0.04  0.06   
  (约1.0mg/ml)
  蒸馏水      0.1  0.09   0.08  0.06   0.04  0.02    0    0.08  0.06  0.04  
考马斯亮蓝
  G－250试剂 5.0  5.0    5.0    5.0    5.0   5.0    5.0   5.0   5.0   5.0   
每管中的蛋
白质量（g）
光吸收值
（A595）

    （3）用标准蛋白质量（g）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
    0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
    2. 微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100g/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。
    0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
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路漫漫其修远兮吾将上下而求索
11楼2008-11-15 21:14:30
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subecho

银虫 (初入文坛)
有一种最最简单的方法，是用一种叫nanadrop的仪器测的，检测只需1微升的样本，使用时直接用加样器将样本溶液加在检测的表面上，无需使用比色皿和毛细管，测一个样1分钟都用不了，检测范围也宽。
老板没钱，肯定没必要自己买仪器，但是可以问问做生物的实验室，有的实验室会有（因为也可以测DNA RNA 都很方便），如果能借到的话，测蛋白浓度就超简单了
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12楼2008-11-15 21:22:48
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subecho

银虫 (初入文坛)
sorry 那个仪器叫nanodrop 刚才打错了
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13楼2008-11-15 21:23:34
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yangzhe2000

金虫 (小有名气)
一般有凯氏定氮法，双缩尿法、酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法
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14楼2008-11-15 22:23:10
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xuancj

木虫 (正式写手)
nanodrop测蛋白不准的除非是纯化的蛋白，一般测出来会比bradford或bca测的要多，意味着实际值要小

[ Last edited by xuancj on 2008-11-16 at 09:34 ]
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15楼2008-11-16 09:23:15
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