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z631535213木虫 (正式写手)
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[求助]
关于简并引物的一点疑问，求帮忙。
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楼准备设计的简并引物是用来扩增 已知基因序列 。但是由于病毒的亚型比较多，所以用简并引物。第一次接触简并引物，有点疑问想请教下大家： Q1. 兼并碱基能否相邻的连续出现?（比如5-ATCGRRATCGYYATCGATCG-3) Q2.针对于我的这个实验——已知基因序列，简并度一般多少比较合适？还是说没有一个定值。（初步定的一条简并引物序列为 5-AABV AWAAAAABAAAAA-3 其中A是已确定的碱基 。简并度 3*3*2*3=54？ ） Q3.能参考下大家做过的兼并引物的实验数据吗？比如简并度是多少以及对应的引物使用浓度。楼之前接触的都是常规PCR，一般都是30ul体系含有0.75ul 10uM的正（or反）引物。 |
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A1.简并碱基可以连续出现。 A2.简并度一般100以内较好，不过你的这个引物怎么除了简并碱基全是A，扩增效率可能会很不好，建议换引物，注意四种碱基数量平衡。 A3.简并度100以内的引物，使用时和普通引物一样使用，30ul体系上下游引物可各加1ul 10uM。 |
2楼2016-07-18 15:22:04
z631535213
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-18 20:43:19
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A3中你说“30ul体系上下游引物可各加1ul 10uM”，那我平时做常规PCR所用体系中的引物是不是加的过量了。 因为之前和生工联系过，ta那边有提过“ Y/R/K/M 之类的都属于简并碱基，以Y为例，此碱基表示C和T的简并，我们合成的时候，这2个单体都是同时进样的，比例是1:1的，但是产物是随机的。含有简并碱基的这条链，严格来说，相当于几条链的混合物的。” 那简并度为8的引物配成10uM时溶液中个引物浓度 应该是简并度为1的引物配成10uM时溶液的 1/8 ？请问下我这个理解有没有问题啊。 |
4楼2016-07-18 16:17:56
z631535213
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