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大片段连接载体的有效方法 已有6人参与
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| 最近在做连接实验：用PCR片段（约2kb）连接T载体和表达载体pET-30b，总是连接不上，操作都还规范，也都确定了DNA片段加了A，有酶切位点，连了3、4次了，都连接不上，不知道是什么原因？T载体和加A试剂盒用的都是宝生的，T4DNA连接酶也是宝生的，内切酶是Thermo的，pET-30b载体是实验室保存的。请教各位大侠，这连接到底要注意些什么呢？我以前连接900多bp的片段，无论是连T载体，还是pET-30b，都是一次性连上，怎么片段大了，就死活连不上呢？那么稍大的片段连接载体，有什么窍门呢？需要注意些什么呢？ |
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7楼2016-07-20 19:05:35
kangaroo0513
新虫 (正式写手)
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2楼2016-07-17 09:33:50
原海亮
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- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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你是怎么确定片段加上A了，测序么？另外为什么同时连T载和pet呢，如果这样就没必要做T载体了，直接连pet就行，2K片段也不算大片段，对连接不会有太大影响，不清楚你连接不上具体是个什么现象呢？压根就没有菌落生长，还是挑到菌落但都是空载呢？我觉得你可以直接pcr产物酶切和pet连，这里和片段大小关系不大，就看你酶切是否完全，pcr产物酶切，首先可以保证pcr产物浓度高一些，然后酶切时间延长，确保有一部分pcr产物是被酶切的。载体的处理就得严谨一些了，我一直建议不要从pet空载出发，空载酶切是否完全很难直观电泳判断，如果你手里有已经构建好的pet重组质粒，含有你需要的酶切位点，你可以用它来回收你的目的条带，这样可以通过是否有小片段切出来，判断载体是否被切开了，相对会靠谱些。最后就是连接前检测下片段和载体，看看是否真的回收到了，很多时候。前面进行很好，回收完就去连，但实际上回收那一步出问题，压根就没有回收的片段或者浓度很低，都会导致连接失败。如果片段载体都回收到了，连接体系尽可能的减少载体量，比方说10微升体系，载体1到2微升，片段你可以加8微升甚至超过10微升都可以的，目的就是哪怕只有十个菌落，我也要保证这10个里面有几个是正确的，而不是几百个菌落找不到一个正确 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-07-17 11:14:34
4楼2016-07-19 09:14:52