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[交流] 《读懂天然产物系列》—33—“解放思想，求实创新”，在常规处做出精彩

《读懂天然产物系列》—33—“解放思想，求实创新”，在常规处做出精彩
【Kai-Bo Wang, Da-Hong Li, and Ping Hu，et al. [2016] A Series of β‑Carboline Alkaloids from the Seeds of Peganum harmala Show G‑Quadruplex Interactions】
【本文从骆驼蓬种子中分离得到4对部分外消旋的卡波林生物碱，其中化合物4显示G-四链体结合活性】
引言：天然产物长期以来一直是新药研发的重要先导化合物来源，活性追踪分离是一种可靠的分离活性单体的方法。随着科技手段的进步，各种先进的大型仪器的功能逐渐完善，各种应用软件不断地更新，化合物的分离和鉴定手段更加多样化，活性跟踪药理模型也在不断地精细。
正文：本文作者采用1H NMR检测G-四链体亚氨基氢质子化学位移变化进行G-四链体（DNA G-quadruplex d(TTGGGTT)4)配体寻找，对17种药用植物的粗提物进行了G-四链体结合活性测试，最终发现骆驼蓬种子的粗提物具有很好的G-四链体结合活性，表明其含有G-四链体结合配体。之后，作者对骆驼蓬子进行了系统提取分离，从中得到四对部分消旋化的β-咔啉生物碱，pegaharmines A−D（1−4）。其中，化合物D对三株肿瘤细胞显示了较强的细胞毒性，并表现出较强的G4-DNA结合活性。

作者筛选了17种药用植物进行与G4-DNA的结合能力测试实验，实验结果表明骆驼蓬种子的乙醇粗提物具有很好的G4-DNA结合活性。1HNMR谱中G-quadruplex高场区的亚氨基质子位移发生了明显的变化 (δH=10-12ppm)。

通过细胞实验证明其对PC-3癌细胞系（人前列腺癌细胞）有很好的杀伤作用，其IC50值13.65μg /mL。

根据初筛结果，选取骆驼蓬种子为研究对象，并对其进行进一步的实验分析。骆驼蓬种子经过提取、萃取得到三部分粗提物浸膏，其中总生物碱萃取物显示了最强的G4-DNA结合能力，并且对HL-60 （HL-60人早幼粒急性白血癌细胞），PC-3和SGC-7901（人胃腺癌细胞）细胞系具有较强的抑制活性，其 IC50 值分别为3.48、10.59和11.53 μg/mL。

之后作者对总生物碱粗取物进行系统分离，得到4对部分消旋化的β-咔啉生物碱（化合物A-D），具有罕见的四氢-β-咔啉碳骈合五元内酰胺环的结构骨架。
通过手性HPLC拆分，旋光，实测ECD光谱确定这4对化合物为部分消旋体混合物，通过ECD计算和X-单晶衍射确定了化合物1的绝对构型，通过生物合成途径推测，再结合分子对接模拟，指出Pictet-Spengler反应可能是造成外消旋体产生的主要原因。值得注意的是，化合物1通过X-射线晶体学确定的构象与NOESY实验测得的结果不是完全吻合。在晶体和溶液状态中，化合物1的喹唑酮基团旋转约180度，这一观察表明，具有相同的绝对构型，在溶液中和晶体状态时，可能存在不同的稳定构象。这种部分外消旋现象的存在，指出目前已经由ECD光谱确定了绝对构型的天然产物，实际上可能是部分外消旋混合物。

进一步对化合物4的生物活性进行研究，发现化合物4可以选择性的结合到c-MYC，VEGF和BCL-2原癌基因启动子上形成的平行型G4-DNA上，但不能与端粒形成的混合型G4-DNA结合，且不能与双链或单链DNA结合，表明其具有较好的选择性。实验还指出：β-咔啉生物碱结合在G4-DNA的3’末端，导致了G5的化学位移发生做大的变化。β-咔啉生物碱与G4-DNA的结合活性与其抗癌细胞增殖活性呈正相关，提示这些β-咔啉生物碱可能通过与G4-DNA结合的相互作用发挥其抗癌作用。

作者通过关于异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase)的作用的相关文献，及生物合成的理论知识结合分子对接模拟技术（the molecular docking analysis）又对这些化合物的生物合成途径进行了推测，指出Pictet-Spengler反应可能是造成外消旋体产生的主要原因。

总结：
1、作者采用1H NMR寻找能与G-四链体结合的配体方法，再结合台盼蓝法（the trypan blue method）和MTT法，进行活性跟踪，在确定了活性的同时也明确了化合物作用的分子机制。
2、化合物生物合成途径的推导。常规的做法是先分离出新化合物之后再对其生物合成途径进行推导，但本文作者另辟蹊径，利用异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase)再结合分子对接技术，对新化合物生物合成途径推导。分子对接技术的应用让人眼前一亮，也增加了生物合成途径推导的可靠性。
3、作者实验过程中的细心程度。没有放过实验中的任何细节，由ECD结果与X单晶衍射结果不完全吻合这一现象推测部分外消旋的存在，进一步分离得到一对部分外消旋体。同时大胆的提出了具有相同的绝对构型，在溶液中和晶体状态时，可能存在不同的稳定构象的可能。
4、作者将1H NMR应用与活性跟踪并用，将分子对接技术应用于生物合成途径的推导，真是将各种技术的应用发挥的淋漓尽致。为利用其他的大型仪器以及应用软件为天然产物服务提供了新思路。

上一贴链接：《读懂天然产物系列》—32—“善其事，利其器” —合理选择填料进行柱层析http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=10405850&fpage=1
开帖篇链接：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=8620515&fpage=1[ Last edited by GWBST on 2016-7-18 at 08:46 ]

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