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JoyHale

新虫 (初入文坛)

[求助] Amp板子上长了好多杂菌！问题比较复杂，请各位进来看。很急，请各位大神给点建议！ 已有1人参与

最近在做转化效率，酶切效率，和连接效率的检验。 我们用了一个带有sfgfp绿色荧光的质粒（带有Amp抗性），转到感受态里面, 涂A+的板子 （3个平行）； 再用双酶切这个质粒，把sfgfp去掉，回收，再把backbone和感受态混合，涂板（3个）；再一组双酶切，切胶回收backbone 和 sfgfp，quickligase连接,然后转入感受态（3个）。
14个小时之后，第一组转化：很多菌落，几千个左右吧，3/4的绿色。  第二组，酶切---很多菌落（几十个~一百个吧）只有一个亮的。 第三组连接-----很多菌落（一百个吧），有四个亮的。  
想问下为什么会有这种情况，这个实验重复了好多次，每次几乎都这样。  长了很多没有绿色荧光的杂菌。 非常不合理，本来只有绿色荧光的质粒才有Amp抗性啊！
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1楼 2016-07-02 15:02:20
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51mimi

新虫 (小有名气)
载体可能自连  ，还还是和你的片段与载体比例有很大关系

发自小木虫IOS客户端
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3楼2016-07-03 11:47:31
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JoyHale

新虫 (初入文坛)
对了，用的酶是AscI 和 XbaI.
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2楼2016-07-02 15:46:50
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
JoyHale(youlinglyw代发): 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩 2016-07-06 15:55:43
第一组：直接转质粒，长那么多很正常
第二组：只转化载体骨架长一个亮的，说明你的载体回收的还可以，但也有些没切开的。但是长那么多不亮的，是污染了还是咋了？感觉自连不会那么多啊，而且位点不同。
第三组：长的这四个有可能是原质粒，有可能是目的质粒，提了鉴定一下。  别的那些我推测是污染了，我自己做有时候也这样，提了质粒都不对，分析不出原因。
   现在夏天到了，是污染最严重的时候，特别注意污染问题，祝好。
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4楼2016-07-06 15:50:28
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
1、污染问题：实验过程中要特别注意
2、连接效率：
    （1）一般16℃左右连接5-7个小时即可，或者过夜连接也可以
    （2）连接体系中片段和载体的比例习惯是3：1，或者再大一点
3、酶切问题：可以加大质粒的量，过获得一些片段和载体。
4、转化后恒温培养的时间一般过夜，第二天早上即可，不要太久。
     你出现的是不是卫星菌落。
5、Amp是否已经不太好用了

最后，还是建议加大酶切量，并保证回收效果和回收量。
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5楼2016-07-07 14:17:40
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