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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » GST亲和层析问题
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吾爱102

新虫 (小有名气)

[求助] GST亲和层析问题 已有1人参与

求各位高手指教！
我最近用GST亲和层析柱纯化一批可溶性表达的蛋白，用~20ml的10mM GSH，50mM Tris（PH 8.0）的洗脱液分10次洗脱，洗脱后的蛋白跑AKTA纯化，量特别少，盐酸胍处理GST柱时发现有大量蛋白被洗下来，想问一下，与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白特征是什么，有没有可能我的蛋白沉淀在柱子上？对于这种情况有什么好的解决办法？
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1楼 2016-06-30 21:04:39
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吾爱102

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2016-07-01 11:47:52
GST亲和介质特异性地纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶等。
处理有蛋白洗下来。就是目的蛋白没洗干净被。洗脱缓冲液中的GSH浓度加大洗脱，然后看结果在调整 ...

谢谢！我之前试过将洗脱液的PH降为6.9，这个PH跟我纯化蛋白的缓冲液的PH值一样，您说的将PH降到5.0是有什么道理？另外，我今天准备加大GSH的量到50mM试一下，非常感谢您的帮助！

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3楼2016-07-01 14:36:50
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-04 07:24:01
GST亲和介质特异性地纯化包含谷胱甘肽结合序列的非变性蛋白质，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶等。
处理有蛋白洗下来。就是目的蛋白没洗干净被。洗脱缓冲液中的GSH浓度加大洗脱，然后看结果在调整，还不行，可以洗脱液的PH降低到5.0在试试。祝顺利。
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2楼2016-07-01 11:47:52
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 吾爱102 at 2016-07-01 14:36:50
谢谢！我之前试过将洗脱液的PH降为6.9，这个PH跟我纯化蛋白的缓冲液的PH值一样，您说的将PH降到5.0是有什么道理？另外，我今天准备加大GSH的量到50mM试一下，非常感谢您的帮助！
...

感觉加大谷胱甘肽的浓度会有效些吧，流速也要慢些。另外我个人感觉ph如果差别太大会不会使蛋白变性而不溶。

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4楼2016-07-04 01:09:59
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吾爱102

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 凯伦爱佳佳 at 2016-07-04 01:09:59
感觉加大谷胱甘肽的浓度会有效些吧，流速也要慢些。另外我个人感觉ph如果差别太大会不会使蛋白变性而不溶。
...

确实加大GSH的浓度后洗脱的蛋白量有所增加，感谢！

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5楼2016-07-04 14:53:47
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