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xincer木虫 (小有名气)
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[交流]
关于多重PCR
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有关于多重PCR的问题想请教一下各位： 1.多重PCR中不同基因的扩增效率不同是否会影响结果的可信性？这是否是除了引物二聚体外影响多重PCR结果的最大因素？ 2.如果是。引物的长短及Tm 值是不是应该要求一致；扩增产物长短是不是也应该要求一致？ 3.如果扩增产物的长短一致，那该如何从电泳图分辨产物呢？ 4.不同基因的初始量的不同会不会影响他们的扩增效率；或者说，不同基因初始量的不同导致的对原料的使用率不同，这会不会影响另一个基因的扩增效率？ 第一次做多重PCR，这几个问题搞不懂。 设想是不是应该在多重PCR之前分别做不同基因的扩增效率验证？ |
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2楼2016-05-26 15:38:38
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3楼2016-05-26 15:57:29
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4楼2016-05-26 16:13:57
xincer
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1. 理论上不同的扩增效率会影响结果，但都是一个反应体系，我们认为他们扩增效率一致。所以结果是具有可重复性的。2. 引物的tm值尽量一致，保证与目的基因结合的效率一致。但这只是理论值，实际情况要看实验情况，要摸条件。3. 只要延伸时间足够，扩增产物的长短没有影响，长短可以不一致。4. 只要多重都在指数期，两者不会有太多影响。不过往往是，一个平台期一个指数期没法比较，所以条件还要摸。 传统的跑电泳检测多重pcr的方法已经过时了，建议采用多重荧光定量pcr比较准确。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2016-05-28 14:26:50
xincer
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谢谢老师，我还有一个问题。就是不同基因的初始量不同是否也会影响扩增效率？因为浓度高的基因会和浓度低的基因进行原料的竞争，浓度越高竞争越大这会影响结果吗？ 发自小木虫Android客户端 |
10楼2016-05-28 16:33:23