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半仙0356新虫 (正式写手)
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反转录和PCR问题╭(°A°`)╮ 已有2人参与
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自己提的RNA，浓度1500左右.OD值1.90，用thermo的反转录盒子，先加8.5μLDEPC水，3μLRNA模板，1μL随机引物，65度5分钟后，再加入buffer4μL，dNTP 2μL，酶1μL，酶抑制剂0.5μl，42度2小时，70度10分钟，然后用actin和GAPDH内参PCR，Tm值分别为57/59度，但是电泳后啥也没有，怎么回事儿啊？求解～ @biostar2009 @wizardfan 发自小木虫Android客户端 |
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半仙0356
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7楼2016-05-26 14:00:34
2楼2016-05-24 06:51:02
jackyoung
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首先你得有个引物正确括增出来的正对照，做实验不放对照都是耍流氓，让我们没法猜; 看你的体系，RNA如果是NanoDrop测定的话，1500左右的单位是什么？ug / ml或等价的ng/ul ?还是其它？如果是的话，你的RNA用量有点儿高。还有对于随机引物的描述不理解，如果是随机引物我们的反转录条件不是这样，是不是混合引物（6-mer随机引物+Oligo dT）?65℃后冰上的chill呢？ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-05-24 06:51:47
半仙0356
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4楼2016-05-24 07:49:52