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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩不出目的基因，都是弥散的
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lycpu

金虫 (小有名气)
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PCR扩不出目的基因，都是弥散的
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模板DNA 1ul, dNTP 2ul，buffer 2ul, Taq酶0.2ul,  上下游引物都是0.5ul, dd水14ul.
PCR的反应条件是：预变性 94℃ 5min, 变性94℃ 30s, 退火 60℃ 45s, 延伸 72℃ 90s, 延伸72℃ 10min, 40个循环。求助各位虫友解答。

PCR扩不出目的基因，都是弥散的


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1楼 2016-05-06 19:58:07
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先，从你的DNA电泳结果看，你的DNA 扩增是工作的，酶种类和浓度、反应体积，延伸时间等应该不是大问题。

接下来考虑你的扩增产物目标特异性和尺寸对不对。你应提供你所用的尺标信息及任何对照反应信息，以利分析。从图看，你用的可能是kb尺标，从最小到最亮标为0.5、1、1.5、2、3 kb，因而产物的大小似乎接近你的预期值2.6kb。如果通道2是无DNA底物对照，说明大尺寸产物不是纯引物非特异性扩增聚合结果。

如果以上分析推测正确，你可能存在过分扩增的问题。可考虑减少至20-25.或30循环，或减少模板DNA 100-1000倍，二者要匹配。可设多个应，同时开始，在不同目标循环数暂停，取出一反应再恢复扩增，直至结束。最后的72C延伸10min可省去。过度扩增循环可能导致引物用尽、产物3'端非特异性杂交延伸，破坏扩增效果。另外跑胶加样可少些。

Good luck!

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38楼2016-05-08 04:18:06
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激荡风雷2楼
2016-05-06 19:58   回复  
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wyoming_haha3楼
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ld梁冬4楼
2016-05-06 19:58   回复  
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yuhanh5楼
2016-05-06 19:58   回复  
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franklin66666楼
2016-05-06 19:58   回复  
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wook_ld7楼
2016-05-06 19:58   回复  
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李强制药8楼
2016-05-06 19:58   回复  
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8023xz9楼
2016-05-06 19:58   回复  
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lwlikai10楼
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木楠11楼
2016-05-06 19:58   回复  
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球球木木12楼
2016-05-06 19:58   回复  
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yuyu199313楼
2016-05-06 19:58   回复  
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MikeMatt14楼
2016-05-06 19:58   回复  
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