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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩不出目的基因，都是弥散的
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lycpu

金虫 (小有名气)
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PCR扩不出目的基因，都是弥散的
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模板DNA 1ul, dNTP 2ul，buffer 2ul, Taq酶0.2ul,  上下游引物都是0.5ul, dd水14ul.
PCR的反应条件是：预变性 94℃ 5min, 变性94℃ 30s, 退火 60℃ 45s, 延伸 72℃ 90s, 延伸72℃ 10min, 40个循环。求助各位虫友解答。

PCR扩不出目的基因，都是弥散的


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1楼 2016-05-06 19:58:07
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8023xz

铁杆木虫 (文坛精英)
目的片段多大

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22楼2016-05-06 19:59:26
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 8023xz at 2016-05-06 19:59:26
目的片段多大

2600

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23楼2016-05-06 20:07:40
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lycpu

金虫 (小有名气)
求顶啊！

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24楼2016-05-06 20:08:02
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8023xz

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶扩增速度，延伸时间是不是不够长

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25楼2016-05-06 20:43:34
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 8023xz at 2016-05-06 20:43:34
酶扩增速度，延伸时间是不是不够长

这没做过，不过我们换了保真度高的酶，退火温度也改变了，还是一样的

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26楼2016-05-06 20:55:05
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8023xz

铁杆木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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26楼: Originally posted by lycpu at 2016-05-06 20:55:05
这没做过，不过我们换了保真度高的酶，退火温度也改变了，还是一样的
...

引物呢？引物对吗

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27楼2016-05-06 21:46:17
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 8023xz at 2016-05-06 21:46:17
引物呢？引物对吗
...

引物是公司设计的，应该没问题

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28楼2016-05-06 22:01:48
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西南微生物

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
感觉退火温度是不是有点高
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29楼2016-05-07 00:10:01
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zxp海东青

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
体系是不是太小了

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30楼2016-05-07 07:03:54
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玉玉玉玉珑

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
顶一下，前几天做实验也出现了这种结果

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31楼2016-05-07 08:45:28
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那时年少丶丨

木虫 (小有名气)
同问

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32楼2016-05-07 09:15:24
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黄启秀

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用的这是25的体系 是不是酶加的有点少  我们都是酶0.5buffer2.5   还有引物稀释了吗

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33楼2016-05-07 09:26:02
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黄启秀

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不好意思看错了  20体系   你可以尝试换大一点体系  然后用宽梳子跑  在看看情况

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34楼2016-05-07 09:28:18
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 西南微生物 at 2016-05-07 00:10:01
感觉退火温度是不是有点高

刚开始退火温度55℃也是一样的情况

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35楼2016-05-07 11:13:23
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蛊惑0810

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你试试25微升体系，或者你把高保真酶和普通taq酶按照3:1混合后再加进体系试试

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36楼2016-05-07 22:49:17
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
36楼: Originally posted by 蛊惑0810 at 2016-05-07 22:49:17
你试试25微升体系，或者你把高保真酶和普通taq酶按照3:1混合后再加进体系试试

恩，谢谢

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37楼2016-05-07 22:54:56
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rdfu510

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
首先，从你的DNA电泳结果看，你的DNA 扩增是工作的，酶种类和浓度、反应体积，延伸时间等应该不是大问题。

接下来考虑你的扩增产物目标特异性和尺寸对不对。你应提供你所用的尺标信息及任何对照反应信息，以利分析。从图看，你用的可能是kb尺标，从最小到最亮标为0.5、1、1.5、2、3 kb，因而产物的大小似乎接近你的预期值2.6kb。如果通道2是无DNA底物对照，说明大尺寸产物不是纯引物非特异性扩增聚合结果。

如果以上分析推测正确，你可能存在过分扩增的问题。可考虑减少至20-25.或30循环，或减少模板DNA 100-1000倍，二者要匹配。可设多个应，同时开始，在不同目标循环数暂停，取出一反应再恢复扩增，直至结束。最后的72C延伸10min可省去。过度扩增循环可能导致引物用尽、产物3'端非特异性杂交延伸，破坏扩增效果。另外跑胶加样可少些。

Good luck!

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38楼2016-05-08 04:18:06
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321高山流水

铁杆木虫 (著名写手)
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39楼2016-05-08 09:17:21
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你先测定一下你的dna模板的浓度，以前我出现过这种情况，原因就是DNA浓度太大，而且我建议你看一下酶使用说明书，看看你的酶是不是用量太少，还有就是检查一下你的buffer是否含有镁离子。

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40楼2016-05-08 09:30:41
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lycpu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
40楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2016-05-08 09:30:41
你先测定一下你的dna模板的浓度，以前我出现过这种情况，原因就是DNA浓度太大，而且我建议你看一下酶使用说明书，看看你的酶是不是用量太少，还有就是检查一下你的buffer是否含有镁离子。
...

好的，谢谢

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41楼2016-05-08 12:10:44
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激荡风雷2楼
2016-05-06 19:58   回复  
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wyoming_haha3楼
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ld梁冬4楼
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yuhanh5楼
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franklin66666楼
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8023xz9楼
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lwlikai10楼
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木楠11楼
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球球木木12楼
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yuyu199313楼
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12在路上1419楼
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重小虫20楼
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YAXIDO腐朽42楼
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