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雨落樱木123

铜虫 (初入文坛)

[求助] 连目的基因的表达载体电转到GS115，YPDS平板上只长了一两个或不长。

本人新手做毕赤酵母表达。使用的表达载体是 pPICZαA ，在测序结果正确后，根据Easy Select™ Pichia Expression Kit For Expression of Recombinant Proteins Using p PICZ and p PICZα in Pichia pastoris 这个文献，做电转化到毕赤酵母GS115的实验， 具体是将线性化后的连接液与酵母感受态电转化后迅速加1mL山梨醇然后37℃热浴1小时，然后避光分量涂布在YPDS的平板上，30℃培养箱中培养，但是两天后发现平板上有的没长，有的只长了两个，再继续培养几天还是没长且已长的菌落不是很大。接着挑了几个长的菌诱导表达，发现没有酶活。这个过程虽然影响因素很多但是我做了三次（有一次是电转后没有热浴直接离心，涂板时去掉了一部分的山梨醇。）都是这样的结果，所以我想知道在这个过程中具体哪些步骤出现了问题，除了质粒提取（已验证没问题）。求各位大神不吝指导。谢谢！！
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1楼 2016-04-10 13:38:32
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
热浴应该是30度，2小时

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2楼2016-04-12 20:50:28
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wdl19931214

新虫 (初入文坛)
可以借您点pPICZαA空载体吗？购买也可以。万分感谢！
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3楼2016-05-13 09:12:41
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Joker_wang

金虫 (初入文坛)
应该是30度静置两小时 绝对不是37度

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4楼2016-06-03 02:39:20
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一哟嚯

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Joker_wang at 2016-06-03 02:39:20
应该是30度静置两小时 绝对不是37度

对的，酵母最适温度为30℃，我们是直接30℃培养箱活化一小时。
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5楼2017-05-19 16:28:26
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张张张zhang

新虫 (初入文坛)
请问lz现在怎么样了？我也是同样的质粒和菌，电转做了两次都不出结果，有问题想咨询一下，不知道方不方便？

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6楼2017-07-30 11:04:14
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张张张zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 张张张zhang at 2017-07-30 11:04:14
请问lz现在怎么样了？我也是同样的质粒和菌，电转做了两次都不出结果，有问题想咨询一下，不知道方不方便？

电转加入山梨醇以后，30℃静置培养1小时，然后就直接涂板吗？还是低速离心去除部分上清再涂板？
另外，加入山梨醇以后就直接涂板吗？还是在山梨醇之后再加YPD培养基培养一小时之后涂板？

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7楼2017-07-30 11:07:34
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方余meteor

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 张张张zhang at 2017-07-30 11:07:34
电转加入山梨醇以后，30℃静置培养1小时，然后就直接涂板吗？还是低速离心去除部分上清再涂板？
另外，加入山梨醇以后就直接涂板吗？还是在山梨醇之后再加YPD培养基培养一小时之后涂板？
...

加上复苏培养基低转速摇1小时，然后低速离心留100微升涂布，这些有成熟的protocol啊

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8楼2017-07-31 20:20:50
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