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mRNA-Seq文库构建实验原理相关问题求助 已有1人参与
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初接触mRNA-Seq文库构建实验，用的VATHS mRNA v2 Library Prep Kit。有些原理相关的小白问题请教，望各位别取笑多指教 1. 用磁珠将mRNA从总RNA中纯化出来的原理是什么呢？为什么专用磁珠只吸附mRNA？ 2. 打断mRNA使之片段化的原理是什么？用什么试剂？为什么可以打断？ 3. 为什么要末端修复？是怎么修复的？用的什么试剂？原理是什么？过程怎么样的？ 4. 为什么要末端dA-tailing？用的什么试剂？原理是什么？过程怎么样的？ 5. 接头是什么结构的？怎么设计接头？接头退火的过程是怎么样的？ 6. 文库扩增时用的引物怎么设计的？是什么样的序列？扩增过程？ |
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jianguochen
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
doushifish: 金币+50, ★★★很有帮助 2016-04-01 08:42:08
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1.利用成熟mRNA的poly A tail 特性，磁珠上有修饰oligo dT，与mRNA退火就捕获了mRNA。 2.楼主的试剂盒应该是利用盐离子在加热下打断mRNA的。 3.打断的mRNA反转录之后末端可能有多种情况，但后续的步骤需要先将末端补平，一般就是用DNA polymerase。 4.dA tailing 就是在补平的末端加A，而接头有一个突出的T，这样就TA连接了，末端加A的酶有好几种，你的是哪个我也不知道。 5.不同建库试剂盒的接头类型不一样，比如Y型，颈环等，接头设计比较多样化，一时也说不清楚，你可以看看illumina的接头信息。 6.同5 |
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doushifish2楼2016-03-30 14:58:15
3楼2016-03-31 09:28:03