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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

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[求助] primerstar PCR没有条带是为什么呢？已有3人参与

如题，我用Cdna 扩增表达片段大概2000-3000bp。
Cdna 没有问题，扩增了tub 有带。
我用Taq 酶扩增的时候有带，因为不是高保真的酶所以我想用primerstar 获得片段
试过加了6%DMSO 试过降低退火温度本来的退火温度是67 降到了62 还是没有条带
延伸时间用的2-3min
求解!
我都整了一个月了没有带呀要死要活的。

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1楼 2016-03-18 08:38:35

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jackyoung

新虫 (正式写手)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-18 09:46:30
cDNA扩增长片段是有各种问题的，模板质量得好，浓度合适；选用合适的酶；引物质量合格，高保真酶是应该用高退火的，你可以按照酶的说明书试验一下，扩增效率2000bp/min吧？不用那么长时间。

别坑人，小日本的东西都浮夸，按2k/min是有点儿坑的。我觉得他的原因:
1.瞎折腾，ps酶的buffer有优化，DMSO什么的可以先不用试，直接搞个56-64的梯度试试看，第一步不行先用Taq预括增，没有的话首先怀疑引物，其次是模板;
2.cDNA质量待确认，由于片段较大，反转录的时候一定要用好一点的RT，反转录要保证质量;
3.可以怀疑下引物，至少是认真确认一下你的引物和序列，就有那傻缺把引物设计在启动子或基因下游，没有结果很正常。

发自小木虫Android客户端