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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重组质粒双酶切验证，载体条带可以看到，目的基因条带跑不出来
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韩恋希

铜虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒双酶切验证，载体条带可以看到，目的基因条带跑不出来 已有5人参与

转染感受态细胞挑菌纯培养之后试剂盒小提质粒，右边图是提的质粒直接跑的pcr，左边是酶切之后再跑的，载体pc DNA3.1(+)，载体+目的基因应该大约六千，质粒五千，目的基因一千，
1.不知道为什么一直跑不出来一千的条带
2.挑一个菌落摇菌为什么质粒会有五千和六千两种？

重组质粒双酶切验证，载体条带可以看到，目的基因条带跑不出来


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1楼 2016-03-12 22:13:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

shx0743

新虫 (正式写手)
一千的带子看不到也可能是因为亮度比，我们扫胶的时候可能由于大片段看起来很亮导致小片段看不清，你可以尝试加大上样量再跑一下试试！

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9楼2016-03-13 21:04:16
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普通回帖

zhifang889
。

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2楼2016-03-12 22:31:32
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原海亮

木虫 (著名写手)

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右边图提质粒后直接去做pcr的？不懂什么意思，那pcr目的条带应该是多大呢，你右边的图条带特异性也不好，看不出来什么。左边直接酶切的，我怎么看着你左上图，好多质粒根本没有切开呢，不知道你酶切体系和时间。还有提取码质粒直接电泳，一般都是会有两到三天带的，你所谓的五千和六千条带，实际上只是同一个质粒的不同构型而已，比如同一个质粒环状超螺旋和线性开环的，在电泳时候跑的位置是不一样的，。所以质粒没有酶切直接进行电泳，只可以定性的看看质粒是否提取成功以及提取的浓度，对质粒的大小没有参考价值，那需要进行酶切，才可以的，祝好！

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3楼2016-03-13 08:07:14
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-13 08:07:14
右边图提质粒后直接去做pcr的？不懂什么意思，那pcr目的条带应该是多大呢，你右边的图条带特异性也不好，看不出来什么。左边直接酶切的，我怎么看着你左上图，好多质粒根本没有切开呢，不知道你酶切体系和时间。还有 ...

好像试剂盒提取的质粒一般只有一种构型吧？

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4楼2016-03-13 12:50:03
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cch2012

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
4楼: Originally posted by Bioexperixgs at 2016-03-13 12:50:03
好像试剂盒提取的质粒一般只有一种构型吧？
...

质粒在提取的过程中，会由于机械损伤等原因，导致出现两到三条带，即CCC,OC,L三种构型，进行凝胶电泳的时候泳动速度不同，从而会看到两到三天带。提取质量比较好的话会有两条，一般是三条

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5楼2016-03-13 13:19:06
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原海亮

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Bioexperixgs at 2016-03-13 12:50:03
好像试剂盒提取的质粒一般只有一种构型吧？
...

那看你的操作了，我们基本提出来都是三天带的。

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6楼2016-03-13 14:52:32
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thinka

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
转化后，直接挑菌落做菌落PCR，阳性的克隆再去接种摇菌提质粒就好了，如果先接种提质粒，那也可以质粒做模板做个PCR看看有没有目的带。

如果总是找不到阳性克隆那可能是自连了，载体酶切的时候没有切好，构建载体要舍得花钱买好酶，钱是老板的，时间是你自己的
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7楼2016-03-13 16:53:31
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Bioexperixgs

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cch2012 at 2016-03-13 13:19:06
质粒在提取的过程中，会由于机械损伤等原因，导致出现两到三条带，即CCC,OC,L三种构型，进行凝胶电泳的时候泳动速度不同，从而会看到两到三天带。提取质量比较好的话会有两条，一般是三条
...

OMIGA质粒小抽试剂盒，一直是很亮的一条带

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8楼2016-03-13 18:10:32
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linxia_yuer

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先要确定自己的目的基因是否插入到载体上面去了，一般需要做个菌液pcr或者质粒pcr来验证。确定有的话，酶切的体系和时间按照要求来，一般能切到小片段。如果切了跑电泳还是看不到条带，楼上说的条带亮度比也是要注意下，不过看你的主带很亮，应该质粒是够的。检查末端是否同尾酶连接的，能连上但是原有酶切位点就不再识别了。pcr鉴定正常，没有酶切目的条带，建议直接送测序。不要耽搁时间。
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10楼2016-03-14 10:16:17
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