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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR程序
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吕木木

新虫 (小有名气)

[求助] PCR程序 已有2人参与

我要克隆1900bp的片段，用的GXL酶，反应体系是：模板1微升，5×GXL Buffer5微升，MIXdNTP 2微升，引物1微升，酶0.5微升，ddH2O至25微升。
对应程序：94℃30 s，72℃ 2 min，5 个循环；94℃ 30 s，（温度梯度）70℃ 40 s，
72℃ 2 min，5 个循环；94℃ 30 s，（温度梯度）68℃ 40 s，72℃ 2
min，30 个循环；72℃ 10 min，4℃保存，但是一直跑不出来，什么条带都没有，跑了一个学期了，请问怎么修改程序或体系，温度梯度怎么设置？
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1楼 2016-03-05 20:25:33
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gnot_nail

金虫 (正式写手)
这条件是按说明书来的吗？为啥会有5个循环……

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2楼2016-03-05 21:22:16
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sandycool

铁虫 (正式写手)
你好，请问一下，你的反转录用的哪个试剂盒？

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3楼2016-03-05 21:58:48
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sandycool

铁虫 (正式写手)
现在有takara的两个反转录试剂盒，一个是primescript 1st cDNA 试剂盒，另外一个是去除gDNA的试剂盒，不知道用哪个更好

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4楼2016-03-05 22:01:27
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吕木木

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sandycool at 2016-03-05 21:58:48
你好，请问一下，你的反转录用的哪个试剂盒？

塔克拉的

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5楼2016-03-05 22:10:19
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吕木木

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gnot_nail at 2016-03-05 21:22:16
这条件是按说明书来的吗？为啥会有5个循环……

这个程序是以前师兄师姐用过的，一样的品种，一样的酶，只是基因不一样

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6楼2016-03-05 22:11:05
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吕木木

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gnot_nail at 2016-03-05 21:22:16
这条件是按说明书来的吗？为啥会有5个循环……

我很着急，从上个学期开始跑了，一直没什么进展，每天都在跑程序，换引物

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7楼2016-03-05 22:12:00
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sandycool

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 吕木木 at 2016-03-05 22:10:19
塔克拉的
...

请问是takara的哪一款？有一个除基因组DNA的，有一个是1st strand synthesis，具体是哪一款？谢谢

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8楼2016-03-05 22:17:16
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by 吕木木 at 2016-03-05 22:11:05
这个程序是以前师兄师姐用过的，一样的品种，一样的酶，只是基因不一样
...

不要盲目相信前辈啦，基因不一样的话，如果长度不一样，延伸时间就不一样，退火温度也不同，问题还可能出现在引物上，我觉得你可以看看酶的说明书，按上面的来。

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9楼2016-03-05 22:29:59
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吕木木

新虫 (小有名气)
我知道，延伸时间我自己改了的，退火温度做了温度梯度

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10楼2016-03-05 22:42:59
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