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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 空质粒双酶切出现非常相近的两条带？转化长满板？
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)

[交流] 空质粒双酶切出现非常相近的两条带？转化长满板？

最近在做原核表达的构建，出现很多以前没见过的情况，各位虫友请帮忙想想什么原因：
1. 空载体约5400 bp，但提取后跑胶显示比15000 bp还要大，单酶切和双酶切后大小和载体实际大小相差不多，这是其一。
2 单酶切和双酶切后均会出现2条非常相近的条带，载体测过序没有问题，而且所选的酶切位点是载体上单一的
3.双酶切 连接转化后涂板，整板长满了菌就像抗性失效一样，后来我涂了不带抗性的菌证明平板抗性没有问题
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1楼 2014-04-17 12:48:17
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唐tjg

版主 (文坛精英)
2楼2014-04-17 13:23:43
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
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2楼: Originally posted by 唐tjg at 2014-04-17 13:23:43

你也做这个？@唐tjg
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
3楼2014-04-17 13:50:42
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唐tjg

版主 (文坛精英)

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3楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-17 13:50:42
你也做这个？唐tjg...

不做，我只是捡金币的，没看见人家不是散金
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做一个简单的人，踏实而务实，不沉溺幻想，不庸人自扰……
4楼2014-04-17 14:25:19
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sjmr1221
5楼2014-04-17 14:32:34
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落落_无尘

金虫 (初入文坛)
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水墨蓝(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-17 16:29:57
可能是你的一部分质粒没切开，所以电泳会有两条带。空质粒的多酶切位点处只有几个碱基，两个酶不容易接近。没切开的质粒转化就很容易长满板了。
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6楼2014-04-17 15:19:01
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 落落_无尘 at 2014-04-17 15:19:01
可能是你的一部分质粒没切开，所以电泳会有两条带。空质粒的多酶切位点处只有几个碱基，两个酶不容易接近。没切开的质粒转化就很容易长满板了。

我用单个酶分别在通用缓冲液中且，能切出单一条带，但是单酶切的分子量比双酶切的分子量稍稍大些  ps：载体MCS测过序，证明序列没问题
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7楼2014-04-17 16:08:11
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西门吹雪170

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4楼: Originally posted by 唐tjg at 2014-04-17 14:25:19
不做，我只是捡金币的，没看见人家不是散金...

。。。。。在这个版块建议最好发表一下专业见解，帮助人家
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8楼2014-04-17 16:29:40
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
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很明显，存在不完全酶切的情况

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2014-04-17 16:33:48
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唐tjg

版主 (文坛精英)

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8楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-04-17 16:29:40
。。。。。在这个版块建议最好发表一下专业见解，帮助人家...

我是在散金里看见的，就没管那么多
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做一个简单的人，踏实而务实，不沉溺幻想，不庸人自扰……
10楼2014-04-17 16:39:50
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