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[交流]
蛋白质组学 & 修饰蛋白质组学 科学技术和职业生涯发展交流帖
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一，写在前面 作为一个有着5年以上虫龄的老人，很久没在木虫上发帖 了，小硕毕业后从事蛋白质组学和修饰蛋白质组学相关市场推广和学术交流工作，环顾坛子，针对蛋白质组学和修饰蛋白质组学进行全面讲解的帖子基本没有，为能和志同道合的虫友们相互促进相互学习，也丰富木虫的科学交流，特立此贴，针对蛋白质组学特别是修饰蛋白质学方面进行一些概述。 二，行业背景 人类基因组的解码开创了以基因解析为特征的个体化医学新时代。然而，基因型与疾病表型的不相关性揭示出个体化医学的本质在于疾病最相关的功能分子----蛋白质。蛋白质修饰（Protein Post-translational Modification, PTM）是蛋白质行使功能的最高级形态，是表观遗传现象的核心内容。因此，以蛋白质修饰-表观遗传为特征的生物医学研究是个体化医学领域的最前沿。 表观遗传学是研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传修饰, 即探索从基因演绎为表型的过程和机制的一门新兴学科。表观遗传学信息提供了何时、何地、以何种方式去执行DNA遗传信息的指令, 它通过有丝分裂和减数分裂将遗传信息从上一代传递给下一代。表观遗传学的研究内容分为基因转录过程中的调控和基因转录后的调控两部分 。主要包括DNA甲基化, 组蛋白修饰, 非编码RNA等。 组蛋白修饰是表观遗传学研究的重要方向之一。组蛋白有很多修饰形式, 包括乙酰化、甲基化、琥珀酰化，巴豆酰化，磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化等等。由于组蛋白和DNA组成的核小体是染色质结构包装的基本单位，组蛋白修饰能够通过改变核小体构象最终影响整个染色体的结构和功能。组蛋白修饰在转录调节，DNA修复，DNA复制，可变剪切和染色质凝集过程中发挥重要作用，因此也与重大疾病和表型变化密切相关。 蛋白质修饰与表观遗传学是生物医学最前沿的研究领域，是21世纪生命科学与生物技术产业化的战略前沿和主要突破口。国际人类蛋白质组组织宣布全面启动“国际人类蛋白质组计划（HPP）”到国内陆续出来各项政策文件明确宣示在国家政策层面上重点支持个体化医学和蛋白质组学研究与产业化转化。 时间 到了2015年，奥巴马在国情咨文中宣布了一个预算为2.15 亿美元的精准医学计划（Precision Medicine）;何为精准医疗？精准医疗是指以个人基因组信息为基础，结合蛋白质组、代谢组等相关内环境信息，为患者量身设计出最佳治疗方案，以期达到治疗效果最大化和副作用最小化的一门定制医疗模式。紧随其后，中国宣布在2030年前，在精准医疗上将投入600亿元，其中中央财政支付200亿元，企业和地方财政配套400亿元。这意味着以蛋白质组和修饰组为核心的技术将迎来产业化的春天，学了这么多年的生物，做了这么多年实验，我们终于不用再抱怨今天学生物流的汗是当年填志愿脑子进的水，我们广大志在生命科学领域一展宏图的虫友们，需要努力打下扎实的专业基础，为属于我们行业的时代积蓄力量！ 三，专业知识 前面扯得有些远，OK,进入正题。蛋白质的组学层面的研究，主要通过对病毒，微生物，植物，动物，以及人类的蛋白质在不同的环境和条件的影响下，表达水平和修饰水平的变化，来寻找关键的影响基因表达调控和细胞信号通路的蛋白，从而为生物性状改良，诊断标记物筛选和药物靶点的寻找提供科学基础。 在常规蛋白质组学上，主要实验流程为样品制备——蛋白提取——酶解肽段——HPLC分组分——LC-MS质谱检测——生物信息学分析（GO注释，KEGG通路，蛋白结构域和蛋白互作等等）。 在修饰蛋白质组学上，多了一个修饰抗体富集修饰肽段的过程，主要实验流程为样品制备——蛋白提取——酶解肽段——修饰抗体富集（乙酰化，甲基化，琥珀酰化等等）——HPLC分组分——LC-MS质谱检测——生物信息学分析（GO注释，KEGG通路，蛋白结构域和蛋白互作等等）。 而在定量蛋白质组学中，常用的标记技术为iTRAQ/TMT技术(样品为组织)，和SILAC(样品为可稳定穿代的细胞)，下面针对这2中标记技术原理和标准分别阐述： 1，iTRAQ/TMT定量蛋白质组学技术 （1）技术简介 研究不同生理病理条件下组织内蛋白质的表达水平的变化是比较蛋白质组学的核心内容。要揭示上述动态过程往往需要进行多个样本的同步比较分析。近年来，在体内和体外稳定同位素标记基础上，用多维相色谱分离多肽，进而用串联质谱进行相对定量的分析方法已成为高通量比较蛋白质组研究的主要手段之一。 iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国AB Seiex公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用多达8种稳定同位素标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，然后进行串联质谱分析，可同时比较多达8种不同样品中蛋白质的相对含量。 （2）技术优点 l iTRAQ标记技术可在一次实验同时对多达8个样本进行定量分析，降低了反复实验引入的技术误差，8个样品之间可进行任意两两比较，增加实验设计的灵活性。可用于多个时间点蛋白质组动态变化的监测；灵活增加实验重复/技术重复以及进行多个个体样本的研究。 l 该技术为体外标记，可标记各种动物组织、植物组织、微生物、体液、细胞等样本。 l 重复性好，灵敏度高，蛋白覆盖范围广，在单张谱图中同时进行定性与定量。 l 标记完全，标记效率高达97%以上，等质量的同位素标签不增加样品的复杂程度。 l 一次实验可定量3000-5000种蛋白(2个unique peptides以上)。 （3）技术原理 l iTRAQ试剂由三部分组成：1）报告基团（reporter group）相对分子质量分别为113、114、115、116、117、118、119和121 Da； 2）平衡基团（balance group）相对分子质量分别为192、191、190、189、187、186和184 Da； 3）反应基团（peptide reactive group）形成8种分子量为305 Da的等质量同位素标签。 l iTRAQ试剂标记酶解后的肽段，可与氨基酸N端及侧链的一级胺发生反应。在一级谱图中，来自于不用样品的同一肽段，标记后，表现为相同的质荷比。 l 在二级质谱中，报告基团、平衡基团和反应基团之间的键断裂，带不同同位素标签的同一肽段产生质量为113、114、115、116、117、118、119和121Da的报告离子，根据报告离子的丰度可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。 （4）送样标准 l 动物组织的样品量湿重不少于200 mg。 l 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2 g。 l 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5 g；如植物的根，木质部、韧皮部组织等。 l 体液类（唾液、羊水、脑脊液等）10 mL以上，要保证不能溶血；血清要求500 μl以上；尿液要求50 mL以上。 l 如直接提供蛋白质提取物，浓度不少于2 mg/mL，总量不少于1 mg。为保证实验效果，请尽量告知缓冲液成分，如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。 l 在细胞器蛋白质组学方面，提取细胞器或亚细胞器后，蛋白沉淀量在1 mg以上。 （5）实验流程（见下图2.jpg） 2，SILAC定量蛋白质组学技术 (1) 技术简介 SILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技术（Stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC），其基本原理是采用轻、重稳定同位素标记的赖氨酸/精氨酸进行细胞培养，细胞经传代培养6代后，细胞97%以上的蛋白质将被轻、重稳定同位素标记。等量混合标记稳定同位素标记的蛋白质，酶解后，进行质谱分析。SILAC标记技术是体内标记技术，且不影响细胞的功能，灵敏度高，广泛应用于比较蛋白质组学研究中。 (2) 技术优势 l 多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定，后续试验对样品的影响是一致的，减少了试验操作和仪器设备引入的实验误差。 l 体内标记技术，标记效率高达99%。 l 定量线性范围广，尤其对相对差异较大的蛋白定量精确。 l 可以对多种在DMEM、DMEM-F12，1640三种培养基中培养的细胞进行标记。 l 该技术属于体内标记，其标记效率不受裂解液成分的影响，标记效果稳定。 (3)送样标准 l 细胞能够在补充透析胎牛血清的DMEM, DMEM/F12, 1640培养基中培养。 l 标记6代后，需要少量细胞进行标记效率检测。达到97%以上方可放大培养。需50 μL以上细胞沉淀。 l 从培养基中收集细胞后，请用4度预冷PBS洗涤三次，细胞沉淀-80度保存，干冰运送。 (4) 实验流程(见下图3.jpg) 四 , 修饰蛋白质组学应用（含科研case分享，updating） 目前针对不同物种的普通蛋白质组学谱图数据，已经不再具有新颖性。必须要针对得到的组学数据得到的关键蛋白进行深入挖掘，进行功能验证，才能成为一篇漂亮的工作。而蛋白质翻译后修饰是和蛋白质功能息息相关，如组蛋白乙酰化和去乙酰化直接关系到转录激活与沉默，细胞中各种激酶直接受到磷酸化调节其活性。而从组学层面研究这些修饰目前还看还是非常新颖的方向。无论针对一个物种的修饰谱图解析，还是针对某一种修饰（乙酰化，琥珀酰化等）在不同处理的生物样品中的差异，从而解析出和蛋白功能相关的修饰，为分子诊断和药物靶点以及农林性状改良提供新型的技术基础。下面针对不同的case一一解析： 1，蛋白质修饰定性组学 针对某一个物种（如水稻，拟南芥，小鼠，斑马鱼等）里的新型修饰做修饰组学谱图，可作为一个领域的开创性的工作。定性不需要标记样品。 （1）技术路线（见下图4.jpg） 适用于乙酰化、磷酸化、甲基化、巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丁酰化、丙二酰化、泛素化等一系列修饰类型的蛋白质修饰全谱分析，可以检测出全蛋白中发生特定修饰的几乎所有蛋白及对应蛋白上的修饰位点。 (2) 应用 运用高质量泛乙酰化抗体偶联的树脂和高灵敏度液相质谱联用分析，以及高级生物信息学分析，我们在大肠杆菌中鉴定了349个乙酰化修饰蛋白共1070个乙酰化修饰位点，报道了迄今为止单一原核细胞中最大的乙酰化组。（见下图5.jpg） 2，蛋白质修饰定量组学 针对动物组织，植物组织和细胞系，进行不同处理后，使用iTRAQ和SILAC标记技术，研究其在不同处理条件下，修饰水平的差异变化（此处以磷酸化和乙酰化定量组学为例）（见下图6.jpg和7.jpg) 3, 生物标志物，药物靶点和修饰酶底物的寻找 寻找生物标志物（Biomarker）：通过对正常组织和疾病组织的修饰组学，找到在疾病中广泛存在变化的修饰底物，即潜在的生物标志物或药物靶点，为临床诊断提供依据。（图8.jpg左）； 寻找药物靶点：通过对用药和未用药的疾病细胞系或者模式生物，找到在用药后显著发生变化的修饰底物，可作为药物靶点，为新药筛选和设计提供参考（见图8.jpg右）； 寻找修饰酶底物：在药物筛选和病原微生物互作中，在我们关注到修饰酶起重要调控作用后，我们想一步延伸寻找其对下游其他修饰底物（特别是涉及到关键通路和代谢上的修饰）是否还会发生影响。我们需要将酶活性进行抑制或者直接KO该酶基因，然后通过修饰组学看下有底物的变化（见图9.jpg ，以HDACi 抑制去乙酰化酶，从寻找去乙酰化酶底物） 上述是目前关于蛋白质组学和修饰蛋白组学的相关技术知识，后续科学case 会不断更新，如有相互涉及到蛋白组学样品制备，质谱分析，和生物信息学分析，均可在此贴留言。关于生命科学相关就业职业发展也可以~大家相互交流，共同进步。 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------  2.jpg  3.jpg  4.jpg  5.jpg  6.jpg  7.jpg  8.jpg  9.jpg |
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694839002: 回帖置顶 2015-04-20 08:29:26
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楼上同道中人，关于2DE和MALDI-TOF质谱性能，我简单的在此贴里总结，也为其他人参考 1，2DE (双向凝胶电泳)&质谱鉴定蛋白的优劣： （1）2DE做蛋白组学通量太低，一般不超过1000，这大大限制了后续的生物信息数据挖掘；而质谱鉴定至少是在100-2000以上，目前使用Thermo QE,fusion可以做到4000+； （2）2DE重复性差，特别用银染，同样的样品不同次跑胶，可能结果都不一样，即使在某个胶点出现差异，也可能是假阳性，不能够确定其是否是由于操作问题，还是诊断有差异表达； （3）2DE鉴定到的蛋白，切胶进行单蛋白鉴定对蛋白纯度要求很高，一般要90%，最好是考马斯亮蓝染色，不然很容易鉴定不出来，也增加后续质谱鉴定难度； （4）耗时耗力，时间成本和失败后累计实验成本不低，2DE因此存在之前的问题，所以在实验技术稳定上需要花费大量的人力物力，而质谱技术样品制备完成，直接上质谱，基本一个星期就可以出结果，特别是在科研竞争激烈的今天，速度很重要，可能你还在摸索着调试2DE的体系，人家文章就已经发出来了。 2DE在蛋白组研究初期的确起到促进研究作用，但是随着质谱技术的发展和改进，2DE的优势越来越小，已经逐步被取代。 2，MALDI-TOF 和ESI-MS质谱的区别： (1)MALDI-TOF MALDI 的电离方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出。MALDI的基本原理是将分析物分散在基质分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶体，当用激光（337nm的氮激光）照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使样品分子电离。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用于肽质量指纹图谱，非常快速（每次分析只需3~5min），灵敏（达到fmol水平），可以精确测量肽段质量。 (2) ESI- MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，带电液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带多电荷的离子形式进入 质量分析器。ESI-MS从液相中产生离子，一般说来，肽段的混合物经过液相色谱分 离后，经过偶联的与在线连接的高分辨质谱分析，给出肽片段的精确的氨基酸序列,但是分析时间一般较长。 ESI-MS从性能稳定性，分辨率和鉴定样品的通路均高于MADI-TOF，前者可目前我们鉴定到的组学通量记录是 肿瘤细胞10,218个蛋白质； 水稻 8,124个蛋白质； 拟南芥7,560个蛋白质；足以看出其性能卓越； 目前ESI-MS代表的质谱： Thermo Scientific的LTQ Orbitrap Elite Thermo Scientific的Q-Exactive 是公认的现在市面上性能最好的质谱仪， Orbitrap是thermo的一个专利技术。 希望上述对做质谱和蛋白组的小伙伴们有所帮助 |
9楼2015-04-16 09:02:18
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694839002: 回帖置顶 2015-04-20 09:16:40
wizardfan: 金币+2, thanks for following posts 2015-05-05 06:44:46
694839002: 回帖置顶 2015-04-20 09:16:40
wizardfan: 金币+2, thanks for following posts 2015-05-05 06:44:46
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从今天起，我会陆续和大家分享有关PTM(Post-translational modification)组学的在众多生命科学和医学领域应用的科学Case，对从事蛋白质组和表观遗传，信号转导，基因表达调控等相关研究的科研工作者提供一个新的思路和参考。 一，乙酰化（acetylation）,乙酰化修饰主要是指在蛋白质肽链赖氨酸残基（Lysine）上被加了乙酰基，从而引起蛋白质的功能的变化，而组蛋白乙酰化是目前在表观遗传中研究的热点，在组蛋白（H3，H4，H2B ，H2A）的乙酰化直接和基因的转录激活和抑制是密切相关的。继表观遗传中DNA甲基化和MiRNA，LncRNA和histone modification将是未来生命科学又一轮研究热点和方向。 而我们要深入研究某种修饰的机理和变化，就必须要涉及到调控修饰的酶和供体，对于乙酰化修饰来说，它的供体就是大名鼎鼎的乙酰辅酶A，也是细胞生理生化代谢中核心TCA循环中关键节点。调控乙酰化修饰的酶主要分为乙酰转移酶和去乙酰化酶（目前主要集中在组蛋白的调控没上）： 1，组蛋白乙酰转移酶（Histone acetyltransferases，HATs） 组蛋白乙酰化酶通过对组蛋白赖氨酸残基进行乙酰化修饰，减弱DNA与组蛋白之间的相互作用，辅助激活基因转录。组蛋白乙酰化酶主要分为以下几类： （1）GCN5 家族: 比如 KAT2a, KAT2b等。 （2）MYST (SAS/MOZ) 家族: 如 MYST1, Kat5, MYST2, MYST3, MYST4等。 （3）SRC/p160 核受体共激活家族: 例如 NCOA1, NCOA3。 （4）P300/CBP 家族: 如 p300, CBP。 2，组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs） 组蛋白去乙酰化酶主要承担组蛋白乙酰化修饰的清除，辅助抑制基因转录。它们一般均包含一个催化去乙酰化的结构域。一般参与组成多重复合物。HDACs主要被分为四类： 第I类: HDAC 1, 2, 3和 8； 第II类: HDAC 4, 5, 7 和9，以及HDAC 6 和10； 第III类: SIRT1 -7； 第IV类: HDAC 11。 第I，II，IV类作用方式基本相同，而第III类是一类NAD+依赖性去乙酰化酶。去乙酰化酶主要作用是对乙酰化调控的基因表达进行负调控，调节各种生理活动的正常进行，乙酰化-去乙酰化动态调控异常也伴随疾病的发生。 而目前很多药物都是针对组蛋白去乙酰化酶的抑制剂（HDACi），当下发现的HDACi按其结构分为4类： （1）脂肪酸，如丁酸盐、丁酸苯酯和丙戊酸，其中丙戊酸被用作抗癫痫药物； （2）氧肟酸盐，如TSA是被发现的第1个能抑制HDACs的天然氧肟酸，SAHA[4] 与TSA结构相似，是食品药品管理局批准的第1个可以用于临床的制剂； （3）环肽，如天然产物缩酚酸肽FK-228、 apicidin和环氧肟酸； （4）苯酰胺类，如MS-275、 MGCD0103。有些HDACi如TSA、 SAHA属非选择性，可同时抑制Ⅰ类及Ⅱ类 HDACs；有些 HDACi属于选择性的，如 MS-275对Ⅰ类HDACs的抑制作用强于Ⅲ类HDACs，而对HDAC6、 HDAC8几乎没有影响。但是现阶段对于决定不同HDACs活性的组蛋白特异序列还知之甚少。 3，乙酰化组学科学Case 以上是关于乙酰化修饰的相关概述，而之前的研究主要是针对单个蛋白的乙酰化水平和调控进行研究，从组学层面上高通量的进行研究目前还很少,这极大的限制了我们对生命调控机理的研究，也阻碍了制药工业发展和疾病研究。 下面就乙酰化组学的应用和大家分享科学case. （1）原核乙酰化组解析 1） 2013年1月，南开大学和PTM Biolabs合作针对大肠杆菌（E.coli）进行首次组学解析，首次在原核生物中发现349个乙酰化蛋白，定位了1070个乙酰化修饰位点，这是当时创造了原核生物中乙酰化组学世界纪录,文章发表在当年的《Journal of Proteome Research》(简称JPR)上。全面定位和找到原核生物中的乙酰化蛋白和修饰位点（组蛋白和非组蛋白），从而为基于原核生物的生命活动机制研究提供思路。 paper全文见本页附件 |
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