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miclebibi

银虫 (小有名气)

[交流] 转-载体构建的心得与体会已有71人参与

最近一直在做载体构建,连接转化,在网上看到这样一篇心得,为我自己解决了些许问题,在这里贴出来供大家参考

这两年在美帝净做克隆实验了,以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的,来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天,刚才粗粗统计了一下,在美帝一年零八个月,我构建的质粒超过四百个,其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周,也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种;有单片段酶切插入这种不用脑型的,也有九个片段逐一插入正反向还不同的。专家不敢说,但是熟能生巧,确实积累了不少经验,现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多人都跟我商量(做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊)。

我老板甚至开玩笑说,我们将来开个公司,我专门负责构建(这话听得我想揍他大家同意不?)

想了想还是把经验写下来,一来做个记录,二来博同行一笑,能让大家少绕点弯路则更好。

1. 准备工作

俗话说用欲善其事,必先利其器。我强烈建议大家在做构建之前先找好工具,这样起的效果事半功倍。这里说个笑话,我们系有个新PHD学生,是个印度女孩,很聪明很刻苦,她所在的实验室也很好,不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的,以前一个生物POSTDOC在的时候还好,这个POSTDOC一走,整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念,这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去,要是我就先查查有没有合适的酶切位点,要没有就改造一下质粒一切搞定,这女孩她不懂啊(要命的是她老板固然牛,对这方面也不懂),自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR,P了将近5K的产物去测序,结果测的结果中间有个MUTATION,要懂行的就找找酶切位点,从原来的替换上去,然后测这下这段就行。她呢,又送去了若干了质粒一个接一个的测,一个测序反应这边是8刀,一个质粒测下来就是40刀,她光测序就要花好几百刀(你得佩服老美实验室真有钱呀)。

这件事教育我们准备工作是多么重要。

这里推荐大家两个工具,一个都知道,primer5.0。另一个工具极强大,也不知道国内流行不,叫lasergene,包括设计引物到构建图谱一应俱全,图谱非常漂亮,而且分析酶切位点等等就超NB,如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。

2. PCR

如果没有现成的质粒可供酶切,PCR是最理想也是最方便的策略。关于PCR具体技术坛子内帖很多,我不多说了,这里仅在构建方面谈一谈。

如何设计引物?

首先,看懂质粒图谱!

拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。想用N1质粒,设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉,不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白,你就死了;C1质粒,注意frame,要是移码了,你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3,要弄清楚别弄窜了。一句话,要看懂你的图谱!再多一句,PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。

注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基(大家要用T载体就当我没说)。酶切位点设计也有一定的讲究,我的原则是,能用粘端就用粘端,实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶,如ECORV和SNAB1之类,要是以后还有别的用处就多加点酶切位点,我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到,注意计算TM的时候要减去这些不match的序列,或者选用touch-up策略。

除了酶切位点,还要注意KOZAK序列的问题,很多质粒没有提供KOZAK序列,这要在设计的时候直接在引物上加好。

GENE OVERLAP也比较有用,比方说加个FLAG片段,HIS片段,2A序列之类的,直接设计三引物OVERLAP一下就可以,省得还要再多构建一步,这些都是设计引物时候就要考虑好的。

引物长一点不要紧(我最喜欢两步法了),尤其是对GC比高的序列,有时候引物不长PCR根本不出结果,注意如果GC比较高,这个时候GENE OVERLAP就不要做了,很麻烦,克隆很难挑。

没有合适的酶切位点?

很简单,用同尾酶策略,比方说Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1,Xho1和Sal1(注意连上了切不下来),实在不行就平端吧,只要不超过4KB,平端酶连接也不那么难。

如何选择Taq酶?

选择Taq酶也很关键,首先,高保真(High fidelity)这是必须的,我在国内常用LA KIT,可这边***忑贵,只好用(美)国货。常用的PFU,PHUSION和PFX。PFX50是invitrogen公司的,一度曾卖到脱销,保真性应该是目前最高的,是普通Taq的50倍,对一般基因绝无问题(我同事4.5K PCR产物,居然一个突变都没有),但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR的基因(基因组为模板)就明显不行了;PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高,但是能力很强,略贵点;phusion是NEB公司的,不贵,但是这个酶很怪异,每次用都要把annealing温度调高好几度,否则就出杂带,个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1,但是Taq就不如Invitrogen了,如果实验室有钱,直接买invitrogen的spuermix,什么都混好了,连ddH2o都搞定,只要直接向里加模版和引物就OK,每次我要拿漂亮的结果都用supermix。

还是那句话,读说明书。同是高保真Taq酶,iproof 要求98度起始1min,pfx就要求95起始2min ,延伸有的是72,有的是68,有的要加1uL,有的加0.5,有的TM要低五度,有的高三度,这些必须要读说明书,读且仔细读,这是拿到任何试剂都要做的第一步。

如果基因太难PCR,怎么办?

首先,DMSO是好物,好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项,注意3%-6%,太高Taq酶活性就不行了。如果GC太高而且片段过长的话,DMSO也不行,GC低的不推荐。

我做个过一个2.8k,GC比高达92%的基因PCR,一共做了两周,从保真性最强的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都试过,什么DMSO,甘油,Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的),TAKARA 的LA都试过,都不行,要么不出带,要么就是乱七八糟的带一起来,头晕脑涨的我都打算抹平策略了,后来从别的实验室弄来一个clontech的2 GC rich kit,一次搞定!强烈推荐这个KIT,太牛了,在别家都缴械的时候,它一锤定音,不过价格也比别家都牛,10次反应就130刀,其实实验室大可以备一个,就是防备超高GC又长的片段。不过这个KIT非高保真,送了三个克隆测序,各在不同部位有突变,于是我就从A克隆切一段接到B克隆上,又从C克隆切一段接B克隆上。注意的问题是GC比太高测序也很困难,正常GC能测1K左右,到了High GC就能测个五六百,这时要多准备些引物。

PCR产物的纯化

如果带很单一,又强,直接PCR产物纯化就可以,如果有杂带,但目的带也很强,跑胶,目的带切胶回收。回收这里也有个瓶颈,就是回收率的问题,我试过很多家的KIT,promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适,推荐这个。

关于T载体,我在国内的时候是必用的,到了美帝反倒一次没用过,这边比较流行直接用PCR产物切,就是回收完了直接切上,回收后然后连接,这又回到了最开始设计,要加保护碱基。这个策略好处就是免除了T载体这步,直接插入目的载体,存在的问题就是处于盲做状态,还要加保护碱基。

3. 酶切

我的原则一向是:尽量避免PCR,能酶切的多酶切,实在没办法才去PCR。

这里强烈推荐NEB的内切酶,还记得在有一次用别家的酶切过夜,结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高),而用NEB的酶,切个七十二小时仍旧一切OK,尤其现在NEB还推出了HF的内切酶,没有星活性而且统一都用Buffer4,很好用,在国内我都用TAKARA的酶,基本上还可以。

注意要读说明书,选用什么buffer,多少度,用不用加BSA,这些都要仔细读。

酶切的起始量,PCR产物没甚么可说的,全都切上,如果是从质粒上切片段,要根据你片段大小,片段适中,比如说7kb质粒,有2KB是目的片段,这时切个3-4ug就足够了,如果只有0.2KB,那最好多切点,6ug-7ug 内切酶也没问题。

4. 连接

最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用,但是注意Buffer里有ATP,反复冻融ATP失活得很快,这时有两种办法,一种是象我们chair实验室,每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略,拿到buffer就分装,10uL/管,一次性使用,哪怕就用1uL,剩下的直接扔掉。

连接最重要的注意事项,1,载体总量,2.载体和插入片段比例,3.载体和插入片段质量。

我在回收之后都要测载体浓度,一般来说,载体浓度在20-100ng/uL很好,太低的话碰撞几率低,太高的话又会产生很多非目的克隆,总量从50-100ng就可以,太低失败几率很高,太高克隆太多,挑克隆会很麻烦,反应总体积也有讲究,体积太大载体和目的片段碰撞几率太低,而且对感受态细胞也是个挑战,通用10-15uL,我试过25uL没有问题,40uL就不行了。

载体和插入片段比例一般是1:3,如果很难连接,比如说平端连接,要适当提高载体浓度,同时加大比例1:10,我试过一端平一端粘连接,4kb片段,4KB载体,连接成功率相当高,10个克隆里8个都是阳性的,但是7KB片段,5KB载体的平端连接就连试两周都失败,最后换策略分两段先后克隆进去的,这也給了我很深教训,隔了一阵又做类似的实验,这回我干脆连试都没试,继续分成两段分别连进去的。

3片段连接同理,如果片段不太大,比方说小于3K,3片段连接成功几率很高,但是如果你片段太大,就不行了,我试过4K载体,4K片段A,2K片段B连接,失败四五次,最后还是绕路走了。

5. 转化

这个简单遵循基本的准则就行,话说实验室原来从sigma买感受态(competent cell),后来发现还是自己做的效率高,尤其在使用XL-10细菌的时比DH5a效率要高,需要的话我可以发protocol上来。要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素,实验室原来有个volunteer,做一次失败一次,我就奇怪了,后来才发现他用的居然是加了KANA的LB,直接晕过去了。还有就是氯化钙的问题。氯化钙吸水性很强,吸水后就完蛋了,我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字,就那种玻璃罐,干燥用的),大家要不放心,用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。

6. 鉴定

普通实验做酶切鉴定,阳性率非常高,大多数情况下四个中起码有三个是正确的,很多时候都是百分百正确,这里推荐一种叫fast digest的酶,切个十几分钟跑胶就行了。

如果找不到合适的酶切位点或者有其他问题,比方说有段时间我做个非常新潮的实验,初始步骤的虽然是蓝白筛选,但是白斑也大部分都不对,没办法鉴定就用菌液PCR,最夸张的一次是五十个白斑里面居然就一个阳性的(没办法,该实验特点),这要提质粒可提不起。菌液PCR也有讲究,很多人做菌液PCR鉴定假阳性特多,为甚么?因为你PCR引物选的都在载体上,注意,引物必须分别在载体和插入片段上才准,PCR方法鉴定是极其准确的,我做过数百次菌液PCR,只要PCR条件正确,PCR和酶切结果绝对百分之百对得上。PCR鉴定做起来也很简单,拿个2mL tube,装0.5mL 加入相应抗生素的LB,摇个三小时左后取1uL做模板就行了,楼下有个实验室的POSTDOC特喜欢做直接的菌落PCR,我没试过,效果怎样不好说。

还要多说一句,要注意质粒是低拷贝还是高拷贝,普通的质粒一般4mL摇过夜,1.5mL就能提到500ng/uL 总体积40uL的质粒(根据试剂盒不同,最高提过800ng/uL,也试过200ng/ul,都正常)。如果是低拷贝质粒,象PET系列和pshuttle系列,都是低拷贝,能拿到100ng/uL就已经很好了,这时候需要4ML菌当2ML提,但是最要命的还是Adeasy 质粒(用来做腺病毒的),这个质粒超过30KB,普通KIT回收效率低到忍无可忍,一定要用特定的试剂盒才行,还是那句话,这些都要读说明书。

7. 测序

我们拿到测序结果时候,不仅要核对具体的序列,而且要看测序图,这很重要,因为有时候光看结果对,实际上图显示的不对,或者虽然结果不对,但是图上出现的峰值本身就很怪异不可信,出现突变也不怕,有很大可能性是简并密码子,还要重点检查的地方就是“接头”的地方,因为偶尔引物会出错,比方说少个碱基什么的,还有时候酶切之后连接也会丢一或者俩碱基什么的(这些问题我都碰到过),如果不仔细检查到了后期悔之无及。

还要注意反向测序引物,尤其用到SV40,因为我用PEGFP这套质粒用习惯了,等换成大概是TET-ON那套系统,SV40正好是反过来的,我也没留神,结果测回来的是载体……又吃了一次教训。

最后的最后,回顾来美这段时间,每周工作超过七十个小时,八十个小时也是家常便饭,人虽然还没累垮但也和崩溃相距不远,PAPER只发了两篇还不是什么特牛的杂志,被老板教训倒是隔几周就一次,时至今日居然还有心情整理这类材料,奇怪,奇怪。

今天星期六,早上八点半到,预备加班到六点半。

下班同事来,惊讶的问我如此玩命为甚么。

FOR WHAT?

FOR FUN.

PS:无聊之作,仅博一笑而已。
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miclebibi

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 澜儿 at 2014-08-18 20:22:17
想牛人!真心请教下您,一个长度4600bp的lnc RNA,问了几家公司都不敢做其过表达。说序列长而且局部区域的GC含量较高,请问依您的经验,真的没得做吗?谢谢!

我最长做过2650bp的,没有任何问题,公司不做您可以自己试试看
有问题一起讨论
6楼2014-08-19 12:09:22
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-20 16:56:10
这是篇好文,不过对于我们做植物的,我比较倾向于用KOD,PFU和PHUSION也试过,不过不知道为什么,和植物相关的PCR,总是KOD效果最好(可能是迷信作祟?!)。做连接,遇上一些比较麻烦搞不出来的,试试用NEB的T4和buffer,再加0.5微升promega的T4,往往能取得意想不到的好效果。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
3楼2014-08-18 16:36:34
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
之所以植物用kod合适,是因为植物样品一般dna都抽的有杂质,容易抑制聚合酶活性,kod抗逆性很强,而且有热启动,所以粗模板最好用kod

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-08-19 12:44:55
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baoyu166

禁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

13楼2014-08-20 11:01:03
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三蛰

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
看来原作者对科研是真爱呀。。。
我不会!
14楼2014-08-20 11:27:01
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lijianfu12

银虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
刚好要买酶,楼主这个相当好!可以qq交流或者是?

发自手机版WAP
好好搞学术
21楼2014-08-21 00:10:40
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普通回帖

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

春花秋月何时了


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
不错  很有启发  谢谢
风雨归无一场梦,待得春消夜寝空。
2楼2014-08-18 15:11:33
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

非常不错的说
做一个阳光、开朗的小和尚
4楼2014-08-18 19:40:06
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澜儿

新虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
想牛人!真心请教下您,一个长度4600bp的lnc RNA,问了几家公司都不敢做其过表达。说序列长而且局部区域的GC含量较高,请问依您的经验,真的没得做吗?谢谢!

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-08-18 20:22:17
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卧龙ac

铁虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
恩,全是经验之谈,要好好收藏,读博必定用得上,虽然很多东西没做过,但看这篇文章确实懂了不少,我想问一下,是不是回复字数多了就有金币啊?~~

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-08-19 13:03:48
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卧龙ac

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 卧龙ac at 2014-08-19 13:03:48
恩,全是经验之谈,要好好收藏,读博必定用得上,虽然很多东西没做过,但看这篇文章确实懂了不少,我想问一下,是不是回复字数多了就有金币啊?~~

果然

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-08-19 13:04:01
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尚善若水-lyy

新虫 (初入文坛)

宝贵的经验,感谢分享!
10楼2014-08-19 22:34:55
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