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请各位大牛看下整个过程哪有问题？同源重组基因敲除已有1人参与
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小2最近一直做同源重组基因敲除，快半年了吧，一直卡在重组质粒注入宿主菌那一步！希望各位大人指点下，万分感谢，下面详细说一下： 宿主菌：巴氏杆菌 质粒：pWSK29（低拷贝质粒，有文献报道） 待敲除的目的基因大概1000bp左右，然后设计了2对上下游引物，各900bp,1200bp。重组载体构建比较顺利，分别插入上游，下游，抗性基因（四环素），大概1周时间。接下来是感受态的制备： 于新鲜平板上挑斑于5ml试管中，培养12-16小时，第二天取2ml接种到100锥形瓶中培养至OD600=0.5，按100U/ml加入透明质酸酶，继续培养1小时。 (1) 将菌液于冰上预冷 15min，将菌液分装到预的 50 mL 离心管中，4℃，8000 r/min，离心 10 min，弃上清； (2) 用灭菌预冷的 10%的甘油（milli-Q超纯水）洗涤菌体 2 次，4℃，10000 r/min，离心 10 min，弃上清； (3) 加入 1.5 mL~2 mL 灭菌预冷的 10%的甘油重悬菌体，然后按 50 μL/管分装于灭菌预冷的 1.5ml 离心管中，-70℃冰箱中保存。 接下来是电转： (1) 将 5 μL（150ng） 重组质粒 与 感受态细胞混匀，转至 0.1 cm 冰浴冷的电转化杯中； (2) 设置电转仪参数：电压 2.5 KV/cm，5ms，将电转化杯外面的水擦干后进行电击，电击完毕后，加入液体培养基将菌体混匀，转至1.5 mL 的 EP 管中； (3) 37℃预热后转移至 200 r/min 摇床培养活化 2~3 h，使细菌复壮； (4) 将菌体悬液涂布于含有 四环素R (2.5μg/mL)抗性的平板上，每 200 μL 涂布一块平板； (5) 将平板置于 37℃恒温培养箱直至液体完全吸收，倒置平板，培养 36~48 h 后观察结果。 制备的感受态经过验证是没有污染的，在电击之后涂布带无抗性的平板上均能生长。但是一旦涂布含抗性的平板上就一个都不长。然后我又想是不是电击参数不对，然后又设置了几个参数：1.6,1.8，2.0,2.2,2.4,2.5kv，电击后涂布还是没有生长。总结出几个问题： （1）巴氏杆菌感受态的效率本来就低（文献报道），怎么能制备高效的感受态？ （2）同源重组是不是由于概率低，需要在同一个电击条件下大量转化，才能得到较少的阳性菌株（大肠杆菌例外）？ （3）由于巴氏杆菌荚膜的关系，很难离心，所以加入透明质酸酶，但是还是难以附着到离心管壁，特别在离心第三次的时候10000r/min也有少量菌体悬浮在液体中，只能用枪头慢慢选取上清，有没有一种方法能解决这问题？ （4）最想问的就是，同源重组的概率到底有多大？是不是只有通过大量转化才能得到缺失株？  希望各位大人能细心看完上面的过程，指点下！万分感谢 |
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