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nisiying0701

木虫 (小有名气)

stan

[求助] 蛋白中巯基和二硫键的测定已有2人参与

测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)

请教各位大神,这种方法中稀释倍数(D)和样品浓度(C)是多少?怎么得出的?万分感谢!!!!
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whatdoesn'tkillyoumakesyoustronger.
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一点灵性

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

sytucom: 应助指数+1 2015-08-28 22:03:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by 散仙孔乙己 at 2014-11-10 19:34:05
我想问一下你怎么测的二硫键,那个NTSB配的太麻烦了,有没有什么好的办法?

有,就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂,在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键,然后在Native page gel上可以看到不同的band,从而定量。
6楼2015-07-27 17:32:06
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普通回帖

小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
nisiying0701: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-07-10 16:52:46
样品浓度C=样品的量(15mg)/溶液体积(5ml)=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的,根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后,反应后测定得到的吸光值比较合适(一般0.2-0.8)。
2楼2014-07-10 08:38:33
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nisiying0701

木虫 (小有名气)

stan

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-07-10 08:38:33
样品浓度C=样品的量(15mg)/溶液体积(5ml)=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的,根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后,反应后测定得到的吸光值比较合适(一般0.2-0.8)。

如果按样品浓度3mg/ml正好合适,就不用稀释,即稀释倍数即为1是吗?
whatdoesn'tkillyoumakesyoustronger.
3楼2014-07-10 16:54:55
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小毛孩24

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by nisiying0701 at 2014-07-10 16:54:55
如果按样品浓度3mg/ml正好合适,就不用稀释,即稀释倍数即为1是吗?...

对,是的。如果初始浓度合适,稀释倍数即为1。
4楼2014-07-10 21:08:06
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散仙孔乙己

新虫 (小有名气)

我想问一下你怎么测的二硫键,那个NTSB配的太麻烦了,有没有什么好的办法?
5楼2014-11-10 19:34:05
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1012203014

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有,就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂,在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键,然后在Native page gel上可以看到不同的band,从而定量。...

您好,我最近也需要测这个你那有相关的文献,或者你是在北京吗?我去跟你学学谢谢
奋斗!永不止步!
7楼2015-08-27 08:54:43
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1012203014

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小毛孩24 at 2014-07-10 08:38:33
样品浓度C=样品的量(15mg)/溶液体积(5ml)=3mg/ml
稀释倍数D是自己定的,根据你的样品中巯基的含量不同合适的稀释倍数不同。就是3mg/ml的样品稀释D倍后,反应后测定得到的吸光值比较合适(一般0.2-0.8)。

测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更好的方法
奋斗!永不止步!
8楼2015-09-29 08:48:13
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1012203014

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有,就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂,在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键,然后在Native page gel上可以看到不同的band,从而定量。...

测定总巯基含量时,15 mg蛋白样品溶解于5 mL含8 M 尿素的Tris-Gly 缓冲液(0.086 M Tris, 0.09 M Gly 和 0.04 M EDTA, pH 8.0)。测定自由巯基含量时,15 mg样品溶解于5 mL不含尿素的上述Tris-Gly 缓冲液中,而后加入50 μL Ellman 试剂 (DTNB, 即5,5-二硫基双2-硝基苯甲酸溶于Tris-Gly 缓冲液,4 mg/mL),在25℃条件下保温反应60 min, 离心(5000 g, 15 min),上清液在412 nm 处测定吸光值,以含Ellman 试剂的Tris-Gly 缓冲液为空白对照。
巯基含量的计算公式如下:
SH (μmol/g) = 73.53×A ×D/C
式中:A —除去试剂空白后样品的吸光度值
D—稀释倍数
C—样品浓度(mg/mL)
问题1:上述公式中稀释倍数D是怎么算的(具体的式子),如果完全按照上述方法是不是就是1?
问题2:我测的物质为毛发固体样品,二硫键含量在350μmol/g附近,此种测试方法是否具有可行性
问题3:由于毛发样品中含有非水溶性蛋白,又没哟测量二硫键含量的更好的方法
奋斗!永不止步!
9楼2015-09-29 08:48:56
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缪缪喵喵喵

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 一点灵性 at 2015-07-27 17:32:06
有,就是采用烷基化试剂碘代乙酰胺和碘代乙酸钠的试剂,在二者不同比例条件下可以打开不同的二硫键,然后在Native page gel上可以看到不同的band,从而定量。...

你好,我正在找定量测蛋白质中二硫键的方法,能不能提供具体的一下。急用,万分感谢。
10楼2016-01-10 16:25:55
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