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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 大肠杆菌不表达外源重组蛋白，但基因测序结构是正确的，怎么回事啊，求助各位大侠
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王小七wq

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌不表达外源重组蛋白，但基因测序结构是正确的，怎么回事啊，求助各位大侠已有2人参与

1.构建外源融合蛋白，质粒pET30，宿主DH5α
2.提质粒，测序结果正确
3 转化BL21(DE3)PLYSS，诱导表达蛋白，IPTG 0.5mM，过夜表达
4.提蛋白，我的方法是200ml菌液10000rpm,离心10min,弃上清;10ml binding buffer(含终浓度1mM PMSF，溶菌酶和终浓度20mM β-ME)重悬沉淀;冰浴20min,超声破碎3min,6*6;10000rpm,4度,离心30min,取上清。
5.WB
但是结果木有目的蛋白啊 ，大侠们，是我提蛋白的方法不对吗？
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1楼2014-05-16 12:30:01
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
王小七wq: 金币+5 2014-05-18 10:48:09
转化BL21(DE3)PLYSS这个菌株后，挑几个菌落放在5ml tube里面进行小量诱导表达测试（不需要直接上来就摇200ml的菌）
测试内容包括：IPTG浓度，诱导温度，诱导时间的摸索
蛋白诱导分析：直接取诱导前，诱导后细菌200ul,离心收集菌体，然后用1X loading 悬浮并煮10min，然后进行SDS-PAGE分析

你的结果木有目的蛋白，你试过其他条件了吗？
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2楼2014-05-16 13:22:51
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普通回帖

wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你说的流程大致是可以的。提不到蛋白需要对你整个流程的细节再进行一次分析。不知道你自己分析过没有。这里有两三个点可以给你参考一下。
1.培养温度，诱导是有温度要求的。
2.破碎功率，过高的功率蛋白热变性，过低则不释放。
3.是否有蛋白酶的作用或者其他原因造成目的蛋白降解？
其他你自己看看，是不是实验细节的问题。比如温度，湿度，杂质污染等情况。
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3楼2014-05-16 13:25:36
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-16 13:22:51
转化BL21(DE3)PLYSS这个菌株后，挑几个菌落放在5ml tube里面进行小量诱导表达测试（不需要直接上来就摇200ml的菌）
测试内容包括：IPTG浓度，诱导温度，诱导时间的摸索
蛋白诱导分析：直接取诱导前，诱导后细菌20 ...

做过时间梯度6h,18h,24h
温度26，37
IPTG梯度0.1mM,0.5mM,1mM
可结果是eGFP蛋白有表达，融合蛋白没表达。
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4楼2014-05-17 19:32:04
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-05-16 13:25:36
你说的流程大致是可以的。提不到蛋白需要对你整个流程的细节再进行一次分析。不知道你自己分析过没有。这里有两三个点可以给你参考一下。
1.培养温度，诱导是有温度要求的。
2.破碎功率，过高的功率蛋白热变性，过 ...

诱导温度，时间和IPTG浓度都做过优化，温度选择的是26度，有文献参考说低温有助于融合蛋白的可溶性表达。
至于超声破碎，超声6秒间隔6秒，3min,脉冲40，应该没有问题，因为我的对照组蛋白提出来了。
而且提蛋白过程中加蛋白酶抑制剂（1mM PMSF和1mM EDTA），WB结果不可能降解这么完全啊。我的融合蛋白是eGFP-目的蛋白-His,GFP抗体识别后,只有在30kD（GFP分子量28）附近有带，个人认为即使蛋白降解也不可能降解这么完全啊。
蛋白出不来，郁闷死了，您说的湿度影响指的什么啊，请赐教
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5楼2014-05-18 11:02:33
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gyesang

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引用回帖:
4楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-05-17 19:32:04
做过时间梯度6h,18h,24h
温度26，37
IPTG梯度0.1mM,0.5mM,1mM
可结果是eGFP蛋白有表达，融合蛋白没表达。...

这种情况也是有的，跟基因有关，这个载体不表达的话，你就换换载体试试，pGEX系列的，pSUMO的，pMBP等
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6楼2014-05-18 16:50:13
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-18 16:50:13
这种情况也是有的，跟基因有关，这个载体不表达的话，你就换换载体试试，pGEX系列的，pSUMO的，pMBP等...

有没有可能是蛋白表达了，没有被我提出来？我的目的蛋白是真核膜蛋白。
如果换载体的话，我又一夜打回解放前了。前天刚换Q5超高保真酶，成本太高啊，肉疼
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7楼2014-05-18 19:50:41
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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引用回帖:
7楼: Originally posted by 王小七wq at 2014-05-18 19:50:41
有没有可能是蛋白表达了，没有被我提出来？我的目的蛋白是真核膜蛋白。
如果换载体的话，我又一夜打回解放前了。前天刚换Q5超高保真酶，成本太高啊，肉疼...

膜蛋白就是比较难表达，表达界的难题
有没有表达，去诱导前和诱导后的跑个胶就知道啦，用不着先纯化
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8楼2014-05-18 22:45:20
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王小七wq

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-18 22:45:20
膜蛋白就是比较难表达，表达界的难题
有没有表达，去诱导前和诱导后的跑个胶就知道啦，用不着先纯化...

好的，谢啦
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9楼2014-05-19 13:49:35
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marryna

新虫 (初入文坛)
膜蛋白，祝你好运吧！
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10楼2014-05-22 15:47:37
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