应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜     石溪大学接受考研调剂申请>

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 已构建pcdna3.1的载体于CHO细胞，但蛋白细胞内表达，有意义吗？下一步如何做？
【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
91/1返回列表
查看: 1457  |  回复: 8
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
【悬赏金币】回答本帖问题，作者kehope将赠送您 5 个金币

kehope

金虫 (小有名气)

[求助] 已构建pcdna3.1的载体于CHO细胞，但蛋白细胞内表达，有意义吗？下一步如何做？已有3人参与

各位虫友小弟初来乍到，功能也不是很熟悉。上面的悬赏金币看不懂，如果有合适的回答我再直接给金币吧= =估计明天会有二十个了。

我现在目标是想获得一个有活性的蛋白。
目前的进展是已经构建好了载体（带HIS标签），并且把该载体转染进入了CHO细胞，并且经过G418筛选初步获得了稳定株。稳定株的鉴定目前只做了WB。

目前遇到到的技术壁垒是，想要的蛋白应该是细胞内表达，没有在培养基中表达，我看了一些中文文献，在CHO中最后获得蛋白的，基本都是在表达到培养基中之后再纯化得到，还没有看到把细胞裂解后，分离纯化得到目的蛋白的例子。
可能是我看的文献还不多，所以请教下虫友，以下几个问题：
1、有没有可能在细胞内表达的蛋白，最后获得了也还是有活性的？
2、细胞内表达的蛋白用什么裂解液裂解细胞，使得细胞内的蛋白释放出来，并且还保持活性？
3、如果是细胞裂解的方法，细胞裂解液通过镍柱纯化回收有什么具体操作的步骤或者试剂推荐码？

万分感谢啊！！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼2014-04-15 00:29:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先确定你的基因前面有没有信号肽。
如果没有，加上。
CHO 表达的绝大多数都是外泌的。细胞内的不好纯化，产量也不会太高。

在实验的开始把所有的问题想好。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

kehope
2楼2014-04-15 11:24:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kehope

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小周 at 2014-04-15 11:24:07
先确定你的基因前面有没有信号肽。
如果没有，加上。
CHO 表达的绝大多数都是外泌的。细胞内的不好纯化，产量也不会太高。

在实验的开始把所有的问题想好。

谢谢你的回复。
设计了两个质粒，一个目的蛋白片段是全长的就是有信号肽，一个目的蛋白片段只是成熟肽的部分。
有信号肽的做出来也只是细胞内表达。
所以现在是在用仅仅是成熟肽的那个片段进行后续表达。
细胞内蛋白表达确实比较复杂，效率比较低，这是可以理解的。
请教下有没有具体操作的方法，例如怎么裂解细胞？怎么纯化过柱子？过了柱子怎么鉴定滤液。。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-04-15 12:25:18
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kehope

金虫 (小有名气)
顶一下，等大神

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
4楼2014-04-15 21:04:56
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

antibodyknow

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果方便，可以告知是何种蛋白，我可以帮你分析一下，分泌表达的可能性。如果你的需求量不是太大（如1-10mg).可以考虑用瞬时表达的方式制备分泌蛋白，纯化比较方便，而且所需的时间也比较短。百特美博（www.bettermab.com)可以保证在2-3周完成基因的亚克隆，表达和纯化，并提供毫克级的纯化蛋白。
赞一下 回复此楼
5楼2014-04-15 22:23:41
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luyangji

新虫 (初入文坛)
你的问题解决了么，我现在也做重组蛋白
赞一下 回复此楼
6楼2015-05-28 17:44:06
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kehope

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luyangji at 2015-05-28 17:44:06
你的问题解决了么，我现在也做重组蛋白

就这个蛋白我后来转去做原核表达。如果钱多，这个真核载体做下瞬时转染问题也不大。
你做重组蛋白这个范围比较大，具体问题具体分析

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-05-29 01:03:00
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

CHO蛋白表达和HEK293蛋白表达，瞬转也能得到吧，楼主后来是怎么解决的
赞一下 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-07-31 11:33:19
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiatianli888

金虫 (初入文坛)
楼主稳定转染的筛选过程是用的什么办法，可以把参考的文献发我一个么，最近用G418筛选CHO细胞老是死，文献方法又太多，多谢多谢
赞一下 回复此楼
9楼2015-12-16 10:34:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 kehope 的主题更新
91/1返回列表
不应助 确定回帖应助 (注意：应助才可能被奖励，但不允许灌水，必须填写15个字符以上)
普通表情 龙 兔 虎 猫 论文翻译-EnPapers美助理教授团队-SCI英文润色
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 最近遇到这样一个问题 4+4 asd123gfa689 2024-04-18 8/400 2024-04-19 18:19 by ca0yan9
[育儿交流] 小孩7岁，上一年级，不自信，学习较差 10+7 ljaxida 2024-04-16 33/1650 2024-04-19 18:14 by zxl_1105
[有机交流] 紫外光谱 50+3 54胡 2024-04-17 3/150 2024-04-19 10:48 by Nanamiwww
[论文投稿] 国家重点研发计划论文可以发MDPI里的期刊吗 +4 lin_2018 2024-04-17 4/200 2024-04-19 08:46 by TsolmonZ
[博后之家] 博后进站年龄可以超过35岁？ +8 suesong0818 2024-04-14 8/400 2024-04-18 08:38 by charles-c
[考研] 0854计算机技术316分调剂，求求导师 捞我一下，有学就上 +6 zhushijie218 2024-04-16 7/350 2024-04-17 23:33 by petro
[有机交流] 怎么清洗烧瓶 20+5 ww34523 2024-04-16 6/300 2024-04-17 15:20 by 591950582
[考研] 322求调剂 +7 本己上岸 2024-04-16 7/350 2024-04-17 11:49 by duanxz
[基金申请] 迟国泰通过向学生发放劳务费再回收的方式套取科学基金重点项目 +6 babu2015 2024-04-13 7/350 2024-04-16 20:32 by sundiv
[考博] 24计算机申博 +4 学无止境er 2024-04-13 6/300 2024-04-16 19:15 by 学无止境er
[考研] 材料专硕329调剂遗留难民 +9 Kaylawander 2024-04-13 9/450 2024-04-15 19:21 by mumin1990
[考研] 347求调剂 +4 安谷先生 2024-04-15 4/200 2024-04-15 18:27 by huao连
[考研] 328求调剂 +3 send rgsc 2024-04-14 7/350 2024-04-15 18:17 by zw_muchong
[考研] 322求调剂 +6 本己上岸 2024-04-15 7/350 2024-04-15 14:19 by mthwyj
[考研] 化学、材料类最后调剂机会！！！ +3 加油努力就好 2024-04-14 10/500 2024-04-15 09:05 by 任pen
[考研] 287求调剂 +6 南沨 2024-04-14 6/300 2024-04-14 23:08 by lincunhui
[考研] 290求调剂 +3 杨yhr 2024-04-14 5/250 2024-04-14 21:50 by coco1981
[考研] 309求调剂 +3 留不住放不下 2024-04-14 6/300 2024-04-14 15:28 by 19902169
[考研] 323求调剂 +15 啊Q精神～ 2024-04-13 17/850 2024-04-14 12:44 by qjhawk
[考研] 284生物与医药求调剂（考数学没过A区国家线） +5 胖男孩 2024-04-12 5/250 2024-04-13 18:38 by yezixiaop
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭