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实时定量PCR问题请教已有3人参与
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各位大侠好， 小妹在做实时定量PCR时，同一基因同一模板做的2个不同重复，在实验结果Ct值中，会一个显示NA，一个显示Ct值为33（这样的情况有好多次了，不仅仅针对这个基因或模板）。我的操作是同一基因同一模板的不同重复，先做个预混体系，然后在分装。不同重复之间的差异就是分装了一下而已。现在的问题就是怎么会一个是NA，一个有Ct值呢，虽然Ct值挺大的了。实时定量PCR仪器没有问题，其他人的没有类似现象。我该怎么改进呢？谢谢帮助   QQ截图20131226222142.jpg |
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whitewave
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本人病了，本来不想回复的，看你应该确实是新手，而且不客气的讲，N多实验也的所谓前辈师兄师姐也不懂，根本就没有见过正规军怎么做的。我给你讲的也是我自己花去国内知名大公司（名字就不说了免得说我给人打广告）学习一周才知道的。首先，CT值太大，你增加模板量是可以的，但是你要注意你的逆转录试剂盒要求的最大模板量，qPCR最小的cDNA浓度或者用量！其次，你可以增加循环次数至45或者50（注意一定要做阴性对照）试下！增加循环当然不可能降低CT值，我让你增加的目的是为了让峰晚的可以起峰产生可以读出来的CT值，但是不是可以一值加，一般50循环就到头了，太多非常容易产生非特异性扩增。最后，再啰嗦一句，不是要做绝对定量才用标准曲线，相对定量的标准流程是需要做的！看样子你连那个小册子---Real-time qPCR手册，手把手教你从菜鸟到高手，都没有读过，有时间读下吧！ |
10楼2013-12-30 20:09:18
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首先给你说下，做2次重复孔这是不对的，至少3个复孔，你如果看过ABI7500或者7300这些比较老一点的机子就知道说明是常规做4个复孔，可以去掉一个不好的，3个复孔才会产生SD，如果你不做我就不知道你最后怎么分析了？当然你可以用手直接写，反正很多人都这么干！ 其次，给你讲下最大的可能性是你的目标基因在模板中浓度太低（你做出来那人孔的CT值都33了，另外一个孔很大可能就是太低软件分析不出来！）！你可以换个细胞株试下，最好是找个阳性对照做下，如果正常就是你的目标基因本身表达太低的问题！这没有办法，换思路。 最后你做预混，具体是怎么做的？做了标准曲线吗？看你做2个孔，我大胆猜测你就没有做吧！如果我猜对了，那你怎么知道模板稀释多少倍合适呢？希望你找个比较标准的流程做下！ 祝你实验顺利！ |
2楼2013-12-27 00:00:26
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