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重组高密度脂蛋白粒子作为化学药物、中药和影像制剂载体的应用。
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重组高密度脂蛋白粒子作为药物和影像制剂载体的研究 脂蛋白是一类具有复杂结构的生物大分子，具有一个由甘油三酯和胆固醇酯组成的疏水性脂质内核，被含有载脂蛋白和游离胆固醇的磷脂单分子层所包裹。磷脂单分子层上的载脂蛋白不仅稳定磷脂层的结构，而且维持着脂蛋白的生物活性，在体内通过不同的受体将脂蛋白转运到不同的细胞中进行代谢。脂蛋白作为内源性的大分子，具有生物可降解性和生物相容性，不会激发免疫反应，以及不会被单核细胞吞噬系统识别并清除，这些优点使得脂蛋白具有作为输送载体的潜力，从而近年来引起了广泛的关注和研究。 高密度脂蛋白(HDL)作为脂蛋白家族中的一员，主要参与了胆固醇逆向转运过程，将外周细胞中的胆固醇逆向输送到肝脏进行代谢。HDL中主要的载脂蛋白是载脂蛋白A-I，在胆固醇逆向转运过程中起着重要的作用。载脂蛋白A-I通过巨噬细胞上的ATP结合盒转运子A1(ABCA1)与胆固醇组合成HDL，然后在肝脏上通过HDL的受体，清道夫受体B类I型(SR-BI)，使肝细胞选择性摄取HDL中被酯化的胆固醇，这个过程即胆固醇逆向转运过程。HDL在肝细胞上的另一个受体是ATP合成酶的β链，介导了HDL的内吞，HDL在肝细胞内与内涵体结合，但没有经过溶酶体的降解，通过逆胞饮重新被排出肝细胞。 根据HDL的特性，例如较小的粒径，被包裹的内核以及被受体调节的摄取，我们设想将高密度脂蛋白构建为一种肝脏主动靶向的载体，能够将不同的物质输送到肝脏中。 我们将含有密码子优化的载脂蛋白A-I cDNA的质粒转入大肠杆菌表达载体BL21(DE3)pLysS中，通过生物工程的方法分离纯化得到大量的重组载脂蛋白A-I。我们验证了重组载脂蛋白A-I具有与野生型载脂蛋白A-I同样的生物活性，能够与磷脂快速重组成HDL。 为了利用HDL参与胆固醇逆向转运的特性，我们在胆固醇的3’位置上连接乙二胺，并且利用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)双酸酐的胺解反应将乙二胺-胆固醇连接到DTPA上，利用硅胶分离纯化出两种化合物： DTPA单酰胺(DTPA-chol)和DTPA双酰胺产物(DTPA-(chol)2)。将两种产物分别与钆离子进行螯合，得到连接胆固醇基团的Gd-DTPA衍生物Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2，使用核磁、高分辨质谱等方法对化合物进行了确认。我们计算出两种钆螯合物的纯度大于99.5%。 我们使用二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、重组载脂蛋白A-I、钆螯合物通过胆酸钠表面活性剂法组装成重组Gd-HDL。使用NaBr密度梯度超速离心法进行分离纯化。然后分别通过动态光散射法、透射电镜、MRI等方法对重组Gd-HDL进行研究，测定了重组Gd-HDL中的蛋白和钆螯合物的浓度，计算出NaBr密度梯度离心的样品回收率；对重组Gd-HDL的粒径、形态以及对水质子的纵向弛豫效率进行了表征，发现重组Gd-HDL的粒径在20-25nm之间，形态为圆盘状，并且其纵向弛豫效率r1要高于商业化的造影剂Gd-DTPA，Gd-chol-HDL的纵向弛豫效率比Gd-DTPA的提高78%，Gd-(chol)_2-HDL的纵向弛豫效率则比Gd-DTPA的提高了20%。 在体外细胞实验中，利用人肝癌细胞HepG2细胞，我们发现重组Gd-HDL具有与野生型HDL相同的生物活性，能够将钆螯合物输送到HepG2细胞中，并且证明是通过细胞上的HDL受体将钆螯合物摄取到细胞中。然后使用CCK-8法测定了两种重组Gd-HDL与商业化造影剂Gd-DTPA对HepG2细胞的毒性作用。 为了研究重组Gd-HDL作为造影剂在体内的成像效果，在大鼠的MRI实验中，通过尾静脉注射剂量为10μmol Gd/kg的重组Gd-HDL后，使用3T MRI仪器在不同的时间点进行扫描，获得T1加权的MRI图像。测量各个时间点的肝脏MRI信号，与注射前的信号进行比较，计算其相对强化率。发现两种重组Gd-HDL能够在低浓度下有效增强肝脏部位的MRI信号，并且持续到24小时仍然有较高的信号，表明重组Gd-HDL可以实现肝脏的磁共振靶向造影。并且大鼠的十二指肠部位的MRI信号也同样得到了增强，表明钆螯合物可能通过胆固醇代谢途径进行代谢，而且Gd-DTPA-chol和Gd-DTPA-(chol)2可能分别代表了胆固醇不同的代谢途径。 我们对重组HDL作为质粒DNA靶向输送的载体进行了研究。在体外细胞实验中，重组HDL在组装有阳离子胆固醇衍生物CDAN后，能够实现DNA靶向输送和提高转染效果的实验目标。在体内实验中，我们研究了重组HDL在小鼠体内的分布，表明重组HDL主要聚集在肝脏部位，而且持续的时间较长。 我们也对重组HDL作为siRNA的输送载体进行了研究。使用5种阳离子高聚物与siRNA进行复合，然后使用中性脂质EPC、载脂蛋白A-I将siRNA复合物包裹起来，得到带负电的重组HDL。实验表明重组HDL与野生型HDL的结构和功能相似。体外细胞实验表明重组HDL能够明显降低细胞中荧光素酶约70%的表达，而且证明重组HDL通过细胞上HDL受体被细胞识别和摄取。然后在小鼠体内实验中重组HDL取得了一定的效果。 [ Last edited by 峰高 on 2013-12-9 at 21:47 ] |
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