【答案】应助回帖

回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

pypsak

金虫 (正式写手)

应助: 58 (初中生)
金币: 961.3
散金: 269
红花: 26
帖子: 446
在线: 740.3小时
虫号: 2541795
注册: 2013-07-11
专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-08-23 11:39:41

1.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；
2.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
3.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错
4.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
5.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
6.增加循环数；
7.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
8.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
9.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；

赞一下(2人)

2楼2013-08-23 09:14:39

普通回帖

Eva2009

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

3楼2013-08-23 11:29:57

loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

应助: 42 (小学生)
金币: 43.2
散金: 1025
红花: 4
帖子: 316
在线: 49.1小时
虫号: 1346820
注册: 2011-07-15
性别: GG
专业: 肿瘤生物治疗

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

引用回帖:

3楼: Originally posted by Eva2009 at 2013-08-23 11:29:57
这些俺也在百度上搜过，有没有试过哪种方法啊。。。。怎么让阴性对照里面不出现引物二聚体...

二聚体很严重吗？有一点不影响特异扩增的话不用管它的吧~ 减少引物量，升高退火温度，加镁离子一起用嘛，实在不行重新设计引物呗，没多少钱。

我会绕一个圈，走回到实验室

4楼2013-08-23 12:53:35

pypsak

金虫 (正式写手)

应助: 58 (初中生)
金币: 961.3
散金: 269
红花: 26
帖子: 446
在线: 740.3小时
虫号: 2541795
注册: 2013-07-11
专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

你跑的是Qpcr？普通pcr真没什么问题的

5楼2013-08-23 13:13:35

足下客

木虫 (正式写手)

MolEPI: 10
应助: 39 (小学生)
金币: 1858.8
散金: 211
红花: 12
帖子: 888
在线: 110.4小时
虫号: 426612
注册: 2007-07-28
性别: MM
专业: 临床分子生物学检验

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-23 18:03:30

做PCR之前，把PCR仪提前打开，先让模块温度升到90度以上，再往里放PCR管。可以在一定程度上减少引物二聚体的产生，但是如果你的阴性对照引物二聚体很严重的话，是无法完全避免的。降低引物的加入量，适当提高Tm值，都可以减少引物二聚体的产生。
以上只是我的个人经验，你可以试一下，如果不行。还是重新设计引物较好。

6楼2013-08-23 13:33:25

Eva2009

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

7楼2013-08-26 09:13:49

Eva2009

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

8楼2013-08-26 09:14:31

Eva2009

禁虫 (初入文坛)

本帖内容被屏蔽

9楼2013-08-26 09:16:53

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

专家经验: +218
MolEPI: 44
应助: 397 (硕士)
贵宾: 0.044
金币: 2106.1
散金: 10
红花: 205
帖子: 5633
在线: 571.6小时
虫号: 1766465
注册: 2012-04-19
性别: MM
专业: 生物大分子结构与功能
管辖: 生物科学综合

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-19 21:01:50

你可以在Primer Premier软件的 Pimer--->Search Criteria---->选Manual（在“Search Mode”框），同时点击“Search Parameters"进入人工搜索参数设置窗口，其中有“Dimer/Hairpin”，可以将“Search Stringency”设置为：very high或者 Moderate。该程序会对引物进行相关参数的搜索和筛选。

Good Luck！

10楼2013-10-19 16:06:17