[求助] 荧光定量双峰的问题

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1楼2013-07-02 10:58:28

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寻梦377

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严格意义来讲，是有影响的，这样的数据不可用，因为一部分引物被用去非特异性扩增，相对于目的片段的引物浓度就小了。
解决方法，重新设计引物，可以用网页版的primer3 plus，提高退火温度，控制目的片段长度，100-150 bp为宜。

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2楼2013-07-02 12:11:10

zhouking8758

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:58:24

纠正楼主一点：定量PCR过程中，特异性产物峰之后的峰绝对有影响，而且影响很大，无法消除。产物前锋是可以通过调整荧光信号收集点的温度来消除的。
至于楼主不同胚龄产物峰图不一样，比较认同5楼的看法，是不是污染了DNA基因组，而且扩曾区域刚好跨了内含子？
在提取RNA过程中，可以通过DNase来消化基因组DNA，同时抽提过程中注意不要吸取到非水相产物。
如果还是排除不了，就需要重新设计引物。

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6楼2013-07-03 10:40:47

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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独孤蚕(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-07-02 12:37:20

你确定后面的峰是非特异片段还是样品RNA中污染了基因组DNA？非特异扩增肯定会影响定量，因为定量是通过荧光总量到达阈值时的循环数目来计算的，后面的峰也会产生荧光，直接影响定量，而且非特异扩增还会竞争引物，影响扩增效率。我觉得你的这对引物问题比较大，不仅后面有峰，而且产物峰前面还有个小峰，很可能是引物二聚体。我认为你需要重新设计引物。

3楼2013-07-02 12:29:02

独孤蚕

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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-02 12:29:02
你确定后面的峰是非特异片段还是样品RNA中污染了基因组DNA？非特异扩增肯定会影响定量，因为定量是通过荧光总量到达阈值时的循环数目来计算的，后面的峰也会产生荧光，直接影响定量，而且非特异扩增还会竞争引物，影 ...

我这个是不同胚龄段采集的不同个体的样品。两个胚龄，一个胚龄挺好的，没有双峰，可是另一个胚龄就出现双峰问题了。我想，如果是引物问题的话，不应该有一个胚龄段是好的啊。另外，污染的基因组DNA合非特异性条带有什么区别吗？如果后峰有影响的话，应该这两种产物都有影响啊。

4楼2013-07-02 13:44:58

cicelyzh

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【答案】应助回帖

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独孤蚕: 金币+3, ★有帮助 2013-07-03 11:35:42

引用回帖:

4楼: Originally posted by 独孤蚕 at 2013-07-02 13:44:58
我这个是不同胚龄段采集的不同个体的样品。两个胚龄，一个胚龄挺好的，没有双峰，可是另一个胚龄就出现双峰问题了。我想，如果是引物问题的话，不应该有一个胚龄段是好的啊。另外，污染的基因组DNA合非特异性条带有 ...

对于荧光定量来说当然都有影响的，但是基因组污染和非特异扩增还是有区别的。如果是污染了基因组DNA，可以通过对RNA样品的DNase消化完全就可以除去。如果是非特异扩增，说明是引物问题，就是没有办法消除的，只有换引物了。如果说你做的样品不是全有双峰，很有可能是基因组DNA的污染问题。我想你的引物跨了内含子吧。

5楼2013-07-02 23:59:33

独孤蚕

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6楼: Originally posted by zhouking8758 at 2013-07-03 10:40:47
纠正楼主一点：定量PCR过程中，特异性产物峰之后的峰绝对有影响，而且影响很大，无法消除。产物前锋是可以通过调整荧光信号收集点的温度来消除的。
至于楼主不同胚龄产物峰图不一样，比较认同5楼的看法，是不是污染 ...

产物前锋调整收集点温度来消除，听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的，如果按照你的方法，是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊？

7楼2013-07-03 11:38:15

zhouking8758

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7楼: Originally posted by 独孤蚕 at 2013-07-03 11:38:15
产物前锋调整收集点温度来消除，听起来可行。我们都是在退火步骤结束之后收集信号的，如果按照你的方法，是不是应该专门建立一个适当的温度点步骤来收集信号啊？...

一般是在产物峰开始起峰前一点的时候收集信号。

8楼2013-07-03 16:10:08

cicelyzh

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 02:58:43

引用回帖:

这个方法虽然说是可行的，但只是针对产物峰前有小峰（一般是引物二聚体）时采用的无可奈何之举。主要是产物形成后再升高温度把小峰熔解掉后读取荧光值。这样做无法避免的问题是PCR过程中形成引物二聚体时与主反应竞争引物，可能影响扩增效率。我觉得最好的办法还是换一对理想一点的引物。我做定量的引物一般都设计2对选其中好的一对用。

9楼2013-07-03 23:27:37

独孤蚕

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9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-03 23:27:37
这个方法虽然说是可行的，但只是针对产物峰前有小峰（一般是引物二聚体）时采用的无可奈何之举。主要是产物形成后再升高温度把小峰熔解掉后读取荧光值。这样做无法避免的问题是PCR过程中形成引物二聚体时与主反应竞 ...

探讨一下理论问题啊。如果我做标曲，在有引物二聚体存在的情况下，扩增效率也是在95%-105%之间。虽然说引物二聚体影响扩增效率，但是目的基因扩增效率也达到了要求。这种结果是不是也可以接受呢？

10楼2013-07-04 08:26:55