【答案】应助回帖

diandong

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2楼2012-12-13 17:49:05

porphybaby

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【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励应助和交流！ 2012-12-13 21:02:19

必须要先加loading buffer 然后再煮的吧。。。不能直接煮的吧~~~

我一般是先弃去培养基以及死掉的细胞，然后用预冷的PBS洗两遍。再用细胞刮铲刮细胞，收集到EP管中，然后再离心。之后加100 uL裂解液，冰上裂解30分钟，其间隔十分钟就用涡旋剧烈震荡30秒。最后12000转离心收集上清。

加完loading buffer之后混匀然后再煮5分钟，上样。

3楼2012-12-13 20:41:56

tinycuke

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想问一下，加loading煮5min上样，剩下的下次还可以再用么？如果可以又能放多久呢？

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4楼2012-12-14 00:31:00

lvanmorison

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5楼2012-12-14 18:28:15

忆-雪

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我也在做细胞的western-blot，我的样品制备是：在细胞培养瓶内养细胞，细胞密度一定要密，然后用遇冷的PBS清晰三遍，使培养瓶中无液体时，用碧云天的裂解液500-400ul/瓶（具体加多少需要预实验确定），进行裂解，至少30分钟，再12000转/分钟，离心10-15分钟，上清液分装，-30或-70保存备用，样品反复冻融后，蛋白降解严重，所以样品制备好后要分装，40-30ul/EP管，够一次用的久可以了，电泳前，已1:1比例加loadingbuffer，混匀后，95度煮沸5分钟就可以上样了！我胶跑的挺好。
另外我想问下你是用传统的方法做western-blot实验，还是用一步法western-blot试剂盒进行实验，我是用后者，说明书是全英文的，我想请教一下你该如何操作？

6楼2012-12-14 18:42:31

忆-雪

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最重要的操作一定要在冰上，在裂解时要不停地晃动

7楼2012-12-14 18:43:58

porphybaby

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引用回帖:

5楼: Originally posted by lvanmorison at 2012-12-14 18:28:15
用PBS洗后，吸干净PBS，不加入裂解液，直接刮下来？
还是不吸干PBS，利用剩余的PBS来刮细胞？
谢谢！...

我一般是再加入一部分新的PBS 之后直接刮下来

你PBS洗的话，就直接倒掉就可以了，不用吸得很干净。因为你之后还要再离心，那里会还有一次机会给你吸尽残留的PBS。

8楼2012-12-14 23:48:56

食品科学2012

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在细胞培养瓶内养细胞，细胞密度一定要密，然后用遇冷的PBS清晰三遍，使培养瓶中无液体时，用碧云天的裂解液500-400ul/瓶（具体加多少需要预实验确定），进行裂解，裂解后刮下细胞，以最高转速离心，取上清，-20度下保存

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9楼2012-12-15 18:18:30