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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)

[求助] 求助Gateway 方法构建载体的经验已有2人参与

本人最近用Gateway 方法构建载体，做到BP反应这一步了，转化大肠杆菌之后做菌液PCR，挑了20几个菌落，没有一个阳性克隆，之前师姐他们都是一次成功的，不是该方法转化效率很高吗？为什么到我这就这么低呀
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1楼2012-05-09 14:47:54
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回帖置顶 ( 共有1个 )

qingfeng2011

金虫 (正式写手)
西瓜: 回帖置顶 2012-05-11 17:36:04
引用回帖:
8楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-09 23:31:15:
如果M也拖尾，很可能是电泳条件有问题，但如果能在估计的大小切出目的条带，应该就不影响后续工作。能否贴电泳图出来看一下。
你做挑菌液，PCR，引物和条件都与你师姐一样么？

这是凝胶回收之后的电泳图，目的条带的大小正确而且浓度很大

凝胶回收之后的电泳图
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9楼2012-05-10 08:13:45
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-09 21:08:45:
我的做法一般是BP反应后，转化TOP10细胞，涂板在加了相应抗生素的平板上，长出菌落后挑单菌落在抗生素培养基中扩培，提质粒酶切测定。

我的是转化DH5α，然后涂板再挑菌做菌液PCR，之前师姐他们都是一次成功的，我的却一个也没有，真不知道问题出在哪了，对了，我的PCR产物凝胶回收之后电泳目的条带上面有拖尾，M也是这样，不知这是否有影响
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7楼2012-05-09 22:12:15
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by dfl204 at 2012-05-10 09:44:44:
加入的PCR产物量大，不一定就好。我们一般反应4小时就够了。
酶在使用之前提前几分钟拿出来放在冰上冻融，稍微离心一下，这样会好一些。

我的片段是2.5Kb，反应时间是不是要长一些？
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11楼2012-05-10 22:19:01
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weil_1982

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by 爱笑的大脸猫 at 2013-12-24 20:55:12
敢问楼主用的什么载体？在下要买载体，一片茫然，求回复

我用pDONR221(invitrogen),有不同抗性的版本。
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17楼2014-01-01 01:22:28
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普通回帖

137167741

至尊木虫 (著名写手)
这么说来，你的转化肯定有问题了。20个都没有，那个就太低了啊 ！
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总有一天我要修改用户名。
2楼2012-05-09 16:32:55
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 137167741 at 2012-05-09 16:32:55:
这么说来，你的转化肯定有问题了。20个都没有，那个就太低了啊 ！

是不是BP反应有问题啊，板上长了很多单菌落啊
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3楼2012-05-09 16:38:30
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-05-09 19:47:35
qingfeng2011: 金币+1 2012-05-09 21:14:30
GATEWAY法BP反应效率很高。楼主用于BP反应的PCR产物有多大？大于5 kb至少要室温过夜才能得到理想的结果。
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4楼2012-05-09 19:30:32
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qingfeng2011

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by starseacow at 2012-05-09 19:30:32:
GATEWAY法BP反应效率很高。楼主用于BP反应的PCR产物有多大？大于5 kb至少要室温过夜才能得到理想的结果。

2.5Kb,反应了11个小时呢，时间够长啊
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5楼2012-05-09 20:57:08
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by qingfeng2011 at 2012-05-09 20:57:08:
2.5Kb,反应了11个小时呢，时间够长啊

我的做法一般是BP反应后，转化TOP10细胞，涂板在加了相应抗生素的平板上，长出菌落后挑单菌落在抗生素培养基中扩培，提质粒酶切测定。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
6楼2012-05-09 21:08:45
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
qingfeng2011: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-10 08:14:09
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-10 13:45:57
如果M也拖尾，很可能是电泳条件有问题，但如果能在估计的大小切出目的条带，应该就不影响后续工作。能否贴电泳图出来看一下。
你做挑菌液，PCR，引物和条件都与你师姐一样么？
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8楼2012-05-09 23:31:15
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-10 13:46:10
加入的PCR产物量大，不一定就好。我们一般反应4小时就够了。
酶在使用之前提前几分钟拿出来放在冰上冻融，稍微离心一下，这样会好一些。
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10楼2012-05-10 09:44:44
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