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【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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wzysllm

木虫 (小有名气)

[求助] 带信号肽的长片段引物设计

我需要表达一些分泌的跨膜蛋白，但是表达载体没有分泌信号肽，所以需要人工PCR在序列前段添加信号肽。

现在引物长度大致为20bp片段+60bp信号肽+9bp酶切位点及保护碱基。

现在引物设计长度较长，请问谁有过相关方面的经验可以分享吗？
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kamiles_007

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1楼2012-03-07 09:21:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
顺便说一句，没必要像2楼说的那么复杂，直接设计好引物在5'端加上你的东西，就能扩增出来，引物的集合主要在3'端，所以5'端加我热为在80BP一下的长度都可以。
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wzysllm
8楼2012-03-08 14:12:16
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wzysllm

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by kamiles_007 at 2012-04-23 19:32:34:
问一个比较菜的问题啊，跨膜蛋白能通过加信号肽变成分泌蛋白吗？

可以，我现在就是做的这个。但是你得手动加上分泌蛋白所需要的信号肽才可以表达。
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12楼2012-04-24 16:05:51
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普通回帖

wzysllm

木虫 (小有名气)
自己顶一下了。

希望大家帮忙。
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2楼2012-03-07 10:45:38
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wzysllm(金币+5): ★★★★★最佳答案 感谢分享！ 2012-03-07 14:04:14
wzysllm(金币+25): ★★★★★最佳答案 再次对你的热心帮助表示感谢！ 2012-03-08 11:15:21
真巧，我也刚解决完一个跟这个一模一样的问题。
做两次PCR，一共设计3条引物。两条5‘的，一条包含部分信号肽序列和部分目的基因片段，用它和3’引物做第一次PCR，取1μl pcr产物用做二次PCR的模板。第二条5‘引物包含部分与第一条5'引物序列和余下的信号肽及酶切位点保护碱基等，PCR,，回收，OK!

另，由于设计两次PCR，出错的可能性升高，测序时可以多测几个，3or4个！
我就是这样做的，没问题！
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3楼2012-03-07 11:16:29
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
我当时也咨询过引物合成公司，他说随着引物长度的增加，出错的概率也增加，建议我全基因合成，而且手头有5,6个类似的信号肽，这个就太贵了。
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4楼2012-03-07 11:20:17
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wzysllm

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-03-07 11:16:29:
真巧，我也刚解决完一个跟这个一模一样的问题。
做两次PCR，一共设计3条引物。两条5‘的，一条包含部分信号肽序列和部分目的基因片段，用它和3’引物做第一次PCR，取1μl pcr产物用做二次PCR的模板。第二条5‘引 ...

非常感谢你的热心帮助

想再问一下，1：第一条5’的引物设计是否可以理解为包括信号肽最后的几个bp以及目的基因的起始序列？大概是多少bp呢？ 2： 请问如何设计第二条5‘引物”包含部分与第一条5'引物序列和余下的信号肽“，两个5’端引物都是多少bp呢？

谢谢。
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5楼2012-03-07 14:41:32
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wzysllm

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 小周 at 2012-03-07 11:20:17:
我当时也咨询过引物合成公司，他说随着引物长度的增加，出错的概率也增加，建议我全基因合成，而且手头有5,6个类似的信号肽，这个就太贵了。

现在打算去人工合成信号肽的60bp的序列，再转入到自己载体里面，构建一个自身带信号肽的载体。以后实验就会方便很多了。
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6楼2012-03-07 14:44:26
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
这个问题对于我来说经常做，我的引物最长的时候达到120bp，带过一个多克隆位点，都没有问题，关键扩增的酶要选择好点的，比如TAKARA的primestar.
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7楼2012-03-08 14:10:51
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wzysllm

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by huguangdong at 2012-03-08 14:12:16:
顺便说一句，没必要像2楼说的那么复杂，直接设计好引物在5'端加上你的东西，就能扩增出来，引物的集合主要在3'端，所以5'端加我热为在80BP一下的长度都可以。

非常感谢你的热心，我现在长链和短链都合成了，到时看结果了。
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9楼2012-03-08 17:06:03
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zhen_fang

银虫 (正式写手)
其实没那么复杂
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10楼2012-03-09 09:35:38
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