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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 转基因植株DNA PCR检测要不就不出带，要不就连水和阴性对照都出带？？？急急急！！！
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seamuse

木虫 (著名写手)

[求助] 转基因植株DNA PCR检测要不就不出带，要不就连水和阴性对照都出带？？？急急急！！！

我最近在检测转基因植株T1和T4代DNA,用CTAB法小提的，DNA原液的浓度是3000ng/ul左右，（见附件）稀释20倍后取2微升做的模板，引物1（有师姐已经用过了，效果还挺好的）扩增的片段大小在950bp左右，25微升体系如下
buffer 2.5，
dntp 2,
引物各1微升，
taq酶（5U）0.2微升
模板 2 微升
水 16.3
扩增程序如下95 5min ,94 50s,56 40s,72 90s,35循环，72,10min.
但是扩增结果总是不好，开始是只有很少的几个样出带，（应该大部分都是阳性植株才对，因为上一代都是检测过的，）其中也包括阳性的质粒对照，见图1，
我以为是引物合成不好，就重新合成了但是结果还是不好，后来又设计了几对引物但结果还是不好，要不就是连水和转基因母本（阴性对照）都出带，要不就是还是和之前一样都不出带，从第2张图开始就是另外的引物跑的了，只要出带的都在目的带的大小左右
图1
上面的一排都没出带，就只有下排3个出带的，最后一个是阳性对照


图2
水也出带了，是什么原因啊，换了水和引物后又都不出带了，而且本来同样的体系这一次水没带，下一次又有了

图3也是同样的情况，水和阴性对照（bfck）都出带了

图4pcr，有类似于弥散的现象，还有的就是最下面很亮类似于引物二聚体，像彗星似的带，这张的图放反了，MAKER也表示反了

图5，前面的都有带，但很模糊，后面的都没有了而且拖尾现象严重，


[ Last edited by seamuse on 2011-5-18 at 18:14 ]
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When you want success as badly as you wanted air, you will get it.----------------------一个人只有当他把追求真理当作一种内在的需要时，才算是真正的...
1楼2011-05-18 17:51:35
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seamuse

木虫 (著名写手)
求回复啊，万分感谢！
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2楼2011-05-18 19:09:32
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谁伴我闯荡

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): good 2011-05-19 12:46:11
seamuse(金币+5): 非常感谢你的建议！！ 2011-05-19 13:12:05
首先排除模板污染，另外就是避免上样过程中样品漂移。只用双蒸水做一次P，看结果如何；
再找一些未转基因的样品，进行PCR，避免基因组出现错配导致的假阳性；
不出带的和弥散的，估计是引物的问题。可以考虑调整一下退火温度，检查一下引物的匹配度。
我能想到的就这些，祝楼主好运~！
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此生愿为扑火蛾，纵是焚化亦无悔
3楼2011-05-19 09:19:15
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seamuse

木虫 (著名写手)
恩，谢谢，发现有水和阴性对照污染后，我就又用无菌水重新稀释的新的引物，跑了下发现水没带了，但是今天又换了对引物后（也是用灭过菌的水稀释的）水又有带了，哎，我是真郁闷了。关于退火温度，我做过梯度的，没多大用处，不太稳定！
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4楼2011-05-19 18:39:15
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seamuse

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 谁伴我闯荡 at 2011-05-19 09:19:15:
首先排除模板污染，另外就是避免上样过程中样品漂移。只用双蒸水做一次P，看结果如何；
再找一些未转基因的样品，进行PCR，避免基因组出现错配导致的假阳性；
不出带的和弥散的，估计是引物的问题。可以考虑调整 ...

恩，谢谢，发现有水和阴性对照污染后，我就又用无菌水重新稀释的新的引物，跑了下发现水没带了，但是今天又换了对引物后（也是用灭过菌的水稀释的）水又有带了，哎，我是真郁闷了。关于退火温度，我做过梯度的，没多大用处，不太稳定！
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5楼2011-05-19 21:34:22
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-23 00:53:56
seamuse(金币+3): 谢谢你啊 2011-09-13 12:36:27
弥散的条带是因为DNA模板浓度太大，试着把浓度调整到50-100ng/ul后进行扩增，浓度太大的话PCR是不容易出来的。
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6楼2011-05-22 09:28:06
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-23 00:54:05
seamuse(金币+3): 谢谢 2011-09-13 12:36:01
不值楼主基因组是什么基因组？哪种植物的？有些植物基因组过大，很不容易扩增出条带。另外，楼主可以做几个梯度试试，因为不同的人手法不同，比如，别人用56℃的退火温度就能扩的很好，而自己就不一定可以，所以最好还是自己做个梯度，找到一个适合自己手法的扩增体系与反应条件。
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7楼2011-05-22 23:46:57
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seamuse

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dfl204 at 2011-05-22 09:28:06:
弥散的条带是因为DNA模板浓度太大，试着把浓度调整到50-100ng/ul后进行扩增，浓度太大的话PCR是不容易出来的。

好的，谢谢啦，我的引物现在都被质粒污染了，正在合成新的引物试试在告诉你结果
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8楼2011-05-24 15:39:46
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seamuse

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-22 23:46:57:
不值楼主基因组是什么基因组？哪种植物的？有些植物基因组过大，很不容易扩增出条带。另外，楼主可以做几个梯度试试，因为不同的人手法不同，比如，别人用56℃的退火温度就能扩的很好，而自己就不一定可以，所以最 ...

我做的是小麦的，梯度也做过了，刚开始没有污染时，做个梯度，有几个退火温度都做过，但就出几条带，后来污染后就是不管多少度都很容易出带了
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9楼2011-05-24 15:41:50
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brightzhu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

seamuse(金币+3): 谢谢！ 2011-09-09 18:52:29
你应该考虑一下纯度和试剂的用量问题
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10楼2011-07-14 08:17:59
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