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dongfangzz银虫 (小有名气)
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酶联免疫吸附技术 一． 实验目的 1、 学习掌握ELISA的原理和操作方法。 2、 绘制IgG 水平曲线，找出反应最佳浓度。 3、 了解探索ELISA反应的最佳条件的方法。 二、实验原理 酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术自20 世纪70年代初问世以来，发展非常迅速，目前被广泛应用于免疫学、医学、生物学等许多领域。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。其基本原理是根据抗原或抗体能在一定条件下结合到固相载体的表面仍保持其免疫活性，抗原或抗体与酶结合形成的结合物仍能保持免疫学和酶的活性。结合物与相应的抗原、抗体结合后，可根据加入相应的酶底物的颜色反应来判断有无相应的免疫反应，而且颜色的深浅与相应的抗原或抗体的量在一定的范围内成正比。由于抗原、抗体的反应在1 种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证实验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的实验步骤可有多种，如用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗夹心法、用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。常用的是间接ELISA法（见图19－1）和双抗夹心ELISA法。 三．实验仪器和试剂 1、 仪器 酶标仪（ELISA Reader），微量可调加样器1套（10、20、100、200、1000 μL），恒温培养箱，pH 计，冲洗器（或洗扳机），洗涤瓶，康氏管，50 mL烧杯，吸管。96孔酶标板或64 孔酶标板。 2、试剂 1）包被液：0.05 M pH9.6碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g, 加水至1000 mL，4℃可保存1周）。 2） 闭液：5％ 脱脂奶粉或0.3％ BSA 3）洗涤液：0.15 M pH7.4 PBS-T（0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4•12H2O,8 g NaCl, 0.2 g NCl,0.5mL Tween-20,加水至1000 mL，4℃保存） 4）底物液：pH5.0 的磷酸盐-柠檬酸缓冲液（0.1 M 柠檬酸24.3 mL，0.2 M磷酸盐25.7 mL，加水50 mL，混匀）， 临用前，在上述缓冲液中溶解40 毫克邻苯二胺（Ortho-Phenglendiaruine, OPD），然后加入30%双氧水0.15 毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用。 5） 阳性对照液：1：100用HAT培养基稀释的小鼠血清。阴性对照液为HAT培养基 6） 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 酶标结合物。 7） 2 M H2SO4 8） 抗原溶液 四．实验步骤 1．抗原包被 取洁净的聚苯乙烯微量酶标板，于每孔内加抗原0.1 毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白 含量10μg/mL），置4℃过夜，用洗涤液洗3 次，每次3 min。 2．封闭 每孔加封闭液100μL，37℃放置30 min。洗涤3 次。 3．加待测血清 于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各100 μL。置37℃ 60 min，洗涤3次。 4．加酶标抗体（二抗）于每孔加酶标抗体各100 μL，置37℃ 60min，洗涤3 次。 5．加临时配制的底物液各100 μL，置暗处15分钟。加2M 硫酸50μL 终止反应。 5．结果判断：（肉眼判断） 若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表示。 注意事项 1、实验时，应分别以阳性与阴性对照控制实验条件，待检样品应一式两份，以保证实验结果的准确性，有时本底高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 2、在ELISA中，进行各项实验条件的选择非常重要，如：固相载体的选择：很多物质可作固相载体，如聚氯乙稀、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素等，可以是凹平板、试管、珠粒等。目前常用的96 孔板为聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，使用前均进行筛选，用等量的抗原包被，同样条件下比较不同载体的均一性和吸附性能。 包被抗体（或抗原）的选择： 将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度好，pH 值适当，吸附时间和蛋白量也有一定的影响。最好通过滴定确定蛋白包被的最佳浓度。 酶的底物和共氢体的选择：共氢体要求廉价、安全、有明显的显色反应，而本身无色。如OPD 有潜在的致癌性，应注意防护。TMB 和ASTS 是目前较满意的共氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常地位作用时间为10～30 min为宜。底物使用液应该新鲜配制。 |
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