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(1)ÀûÓÃͬԴÖØ×é¹¹½¨»ùÒòÇóý¶¯ÎïÄ£Ð͵Ļù±¾²½Ö裺
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¢Û.ͬԴÖØ×飺½«ÖØ×éÔØÌåͨ¹ýÒ»¶¨µÄ·½Ê½(µç´©¿×·¨»òÏÔ΢עÉä)µ¼ÈëͬԴµÄÅßÌ¥¸Éϸ°û(ES cell)ÖУ¬Ê¹ÍâÔ´DNA ÓëÅßÌ¥¸Éϸ°û»ùÒò×éÖÐÏàÓ¦²¿·Ö·¢ÉúͬԴÖØ×飬½«ÖØ×éÔØÌåÖеÄDNA ÐòÁÐÕûºÏµ½ÄÚÔ´»ùÒò×éÖУ¬´Ó¶øµÃÒÔ±í´ï¡£Ò»°ãµØ£¬ÏÔ΢עÉäÃüÖÐÂʽϸߣ¬µ«¼¼ÊõÄѶȽϴ󣬵紩¿×ÃüÖÐÂʱÈÏÔ΢עÉäµÍ£¬µ«±ãÓÚʹÓá£
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(2)Ìõ¼þÐÔ»ùÒòÇóý·¨
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(3)ÓÕµ¼ÐÔ»ùÒòÇóý·¨
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¢Ù ÓÕµ¼»ùÒòÍ»±äµÄʱ¼ä¿ÉÈËΪ¿ØÖÆ;
¢Ú ¿É±ÜÃâÒò»ùÒòÍ»±ä¶øÖÂËÀÌ¥µÄÎÊÌâ
¢Û ÔÚ2 ¸öloxP λµãÖ®¼äµÄÖØ×éÂʽϸß;
¢ÜÈçÓò¡¶¾»òÅäÌå/DNA ¸´ºÏÎïµÈ»ùÒòתÒÆϵͳÀ´½éµ¼Cre µÄ±í´ï£¬Ôò¿ÉÊ¡È¥½¨Á¢Ð¯´øCre µÄת»ùÒò¶¯ÎïµÄ¹ý³Ì¡£[10]
2.2ÀûÓÃËæ»ú²åÈëÍ»±ä½øÐлùÒòÇóý¡£
2.2.1 ÔÀí£º
´Ë·¨ÀûÓÃijЩÄÜËæ»ú²åÈë»ùÒòÐòÁеIJ¡¶¾£¬Ï¸¾ú»òÆäËû»ùÒòÔØÌ壬ÔÚÄ¿±êϸ°û»ùÒò×éÖнøÐÐËæ»ú²åÈëÍ»±ä£¬½¨Á¢Ò»¸öЯ´øËæ»ú²åÈëÍ»±äµÄϸ°û¿â£¬È»ºóͨ¹ýÏàÓ¦µÄ±ê¼Ç½øÐÐɸѡ»ñµÃÏàÓ¦µÄ»ùÒòÇóýϸ°û(ÔÀí¼ûͼ5)[11,12] ¡£¸ù¾Ýϸ°ûµÄ²»Í¬£¬²åÈëÔØÌåµÄÑ¡ÔñÒ²ÓÐËù²»Í¬¡£ÄæתÂʲ¡¶¾¿ÉÓÃÓÚ¶¯Ö²Îïϸ°ûµÄ²åÈë;¶ÔÓÚÖ²Îïϸ°û¶øÑÔÅ©¸Ë¾ú½éµ¼µÄT-DNAת»¯ºÍת×ù×ӱȽϳ£ÓÃ;ÊɾúÌå¿ÉÓÃÓÚϸ¾ú»ùÒòÇóý¡£
2.2.2»ùÒò²¶»ñ·¨
»ùÒò²¶»ñ·¨ÊÇ×î½ü·¢Õ¹ÆðÀ´µÄÀûÓÃËæ»ú²åÈëÍ»±ä½øÐлùÒòÇóýµÄÐÂÐÍ·½·¨£¬ÆäÔÀí¿É¼ûͼ6¡£Í¨³£»ùÒò²¶»ñÔØÌ廹°üÀ¨Ò»¸öÎÞÆô¶¯×ӵı¨µÀ»ùÒò£¬Í¨³£ÊÇneo »ùÒò£¬neo »ùÒò²åÈëµ½ES ϸ°ûȾɫÌå×éÖУ¬²¢ÀûÓò¶»ñ»ùÒòµÄת¼µ÷¿ØÔª¼þʵÏÖ±í´ïµÄES ¿Ë¡¿ÉÒÔºÜÈÝÒ×µØÔÚº¬G418 µÄÑ¡ÔñÅàÑø»ùÖÐɸѡ³öÀ´£¬´ÓÀíÂÛÉϽ²£¬ÔÚÑ¡ÔñÅàÑø»ùÖдæ»îµÄ¿Ë¡Ӧ¸Ã100%µØº¬ÓÐÖалùÒò¡£ÖалùÒòµÄÐÅÏ¢¿ÉÒÔͨ¹ýɸѡ±ê¼Ç»ùÒò²àÒícDNA»òȾɫÌå×éÐòÁзÖÎöÀ´»ñµÃ[13]
2.2.3»ùÒò²¶»ñ·¨µÄÓÅȱµã
Óó£¹æ·½·¨½øÐлùÒòÇóýÑо¿ÐèºÄ·Ñ´óÁ¿µÄʱ¼äºÍÈËÁ¦£¬Ñо¿Õß±ØÐëÕë¶Ô°ÐλµãÔÚȾɫÌå×éÎÄ¿âÖÐɸѡÏà¹ØµÄȾɫÌå×é¿Ë¡£¬»æÖÆÏàÓ¦µÄÎïÀíͼÆ×£¬¹¹½¨ÌØÒìÐԵĻùÒòÇóýÔØÌåÒÔ¼°É¸Ñ¡ÖаÐES ϸ°ûµÈ£¬Í¨³£Ò»¸ö»ùÒòÌÞ³ý´¿ºÏ×ÓСÊóµÄ»ñµÃÐèÒªÒ»Äê»ò¸ü³¤µÄʱ¼ä¡£Ãæ¶ÔÈËÀà»ùÒò×é¼Æ»®²úÉú³öÀ´µÄ¾Þ´óµÄ¹¦ÄÜδ֪µÄÒÅ´«ÐÅÏ¢£¬´«Í³µÄ»ùÒòÇóý·½·¨ÏÔµÃÓÐЩÁ¦²»´ÓÐÄ¡£Òò´Ë£¬»ùÒò²¶»ñ·¨Ó¦Ô˶øÉú£¬ÀûÓûùÒò²¶»ñ¿ÉÒÔ½¨Á¢Ò»¸öЯ´øËæ»ú²åÈëÍ»±äµÄES ϸ°û¿â£¬½ÚÊ¡´óÁ¿É¸Ñ¡È¾É«Ìå×éÎÄ¿âÒÔ¼°¹¹½¨ÌØÒì´ò°ÐÔØÌåµÄ¹¤×÷¼°·ÑÓ㬸üÓÐЧºÍ¸üѸËٵؽøÐÐСÊóȾɫÌå×éµÄ¹¦ÄÜ·ÖÎö¡£
´Ë·½·¨µÄȱµãÊÇÖ»ÄÜÌÞ³ýÔÚEs ϸ°ûÖбí´ïµÄ»ùÒò.µ¥ÖÖµÄϸ°ûÀàÐÍÖбí´ïµÄ»ùÒòÊýĿԼΪI04£¬ÏÖÔڵĻùÒò²¶»ñÔØÌå´ÓÀíÂÛÉÏÀ´½²Ó¦ÄÜÌÞ³ýËùÓÐÔÚESϸ°û±í´ïµÄ»ùÒò£¬Òò´Ë£¬ÔÚES ϸ°ûÖнøÐлùÒò²¶»ñ»¹ÊÇ´óÓпÉΪµÄ¡£ÓûùÒò²¶»ñ·¨½øÐлùÒòÌÞ³ýµÄÁíÒ»¸öȱµãÊÇÎÞ·¨¶Ô»ùÒò½øÐо«Ï¸µÄÒÅ´«ÐÞÊΣ¬
2.3.RNAiÒýÆðµÄ»ùÒòÇóý¡£
ÓÉÓÚÉÙÁ¿µÄË«Á´RNA¾ÍÄÜ×è¶Ï»ùÒòµÄ±í´ï£¬²¢ÇÒÕâÖÖЧӦ¿ÉÒÔ´«µÝµ½×Ó´úϸ°ûÖÐ,ËùÒÔRNAiµÄ·´Ó¦¹ý³ÌÒ²¿ÉÒÔÓÃÓÚ»ùÒòÇóý¡£½üÄêÀ´£¬Ô½À´Ô½¶àµÄ»ùÒòÇóý²ÉÓÃÁËRNAiÕâÖÖ¸üΪ¼òµ¥·½±ãµÄ·½·¨¡£
2.3.1 RNAi×è¶Ï»ùÒò±í´ïµÄ»úÀí
Ë«Á´RNA½øÈëϸ°ûºó£¬Äܹ»ÔÚDicerøµÄ×÷ÓÃϱ»Áѽâ³ÉsiRNA£¬¶øÁíÒ»·½ÃæË«Á´RNA»¹ÄÜÔÚRdRP (ÒÔRNAΪģ°åÖ¸µ¼RNAºÏ³ÉµÄ¾ÛºÏøRNA-directed RNA
polymerase£¬RdRP)µÄ×÷ÓÃÏÂ×ÔÉíÀ©Ôöºó£¬ÔÙ±»DicerøÁѽâ³ÉsiRNA¡£SiRNAµÄË«Á´½â¿ª±ä³Éµ¥Á´£¬²¢ºÍijЩµ°°×Ðγɸ´ºÏÎArgonaute2ÊÇĿǰΨһÒÑÖªµÄ²ÎÓ븴ºÏÎïÐγɵĵ°°×¡£´Ë¸´ºÏÎïͬÓësiRNA»¥²¹µÄmRNA½áºÏ£¬Ò»·½ÃæʹmRNA±»RNAøÁѽ⣬ÁíÒ»·½ÃæÒÔSiRNA×÷ΪÒýÎÒÔmRNAΪģ°å£¬ÔÚRdRP×÷ÓÃϺϳɳömRNAµÄ»¥²¹Á´¡£½á¹ûmRNAÒ²±ä³ÉÁËË«Á´RNA£¬ËüÔÚDicerøµÄ×÷ÓÃÏÂÒ²±»Áѽâ³ÉsiRNA¡£ÕâЩÐÂÉú³ÉµÄsiRNAÒ²¾ßÓÐÓÕ·¢RNAiµÄ×÷Óã¬Í¨¹ýÕâ¸ö¾ÛºÏøÁ´Ê½·´Ó¦£¬Ï¸°ûÄÚµÄsiRNA´ó´óÔö¼Ó£¬ÏÔÖøÔö¼ÓÁ˶ԻùÒò±í´ïµÄÒÖÖÆ¡£´Ó21µ½23¸öºËÜÕËáµÄsiRNAµ½¼¸°Ù¸öºËÜÕËáµÄË«Á´RNA¶¼ÄÜÓÕ·¢RNAi£¬µ«³¤µÄË«Á´RNA×è¶Ï»ùÒò±í´ïµÄЧ¹ûÃ÷ÏÔÇ¿Óڶ̵ÄË«Á´RNA¡£
2.3.2 RNAi»ùÒòÇóýµÄÓŵ㼰ӦÓÃ
¢Ù.±ÈÓÃͬԴÖØ×é·¨¸ü¼Ó¼ò±ã£¬ÖÜÆÚ´ó´óËõ¶Ì¡£
¢Ú.¶ÔÓÚ²¸È鶯ÎÈç¶ÔÓÚһЩÇóýºóСÊóÔÚÅß̥ʱ¾Í»áËÀÍöµÄ»ùÒò£¬¿ÉÒÔÔÚÌåÍâÅàÑøµÄϸ°ûÖÐÀûÓÃRNAi¼¼ÊõÑо¿ËüµÄ¹¦ÄÜ¡£
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2.4ʵÏÖ»ùÒòÇóýµÄÆäËûÔÀí¡£
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3.»ùÒòÇóý¼¼ÊõµÄÓ¦Óü°Ç°¾°£º
¢Ù.½¨Á¢ÉúÎïÄ£ÐÍ¡£ÔÚ»ùÒò¹¦ÄÜ£¬´úл;¾¶µÈÑо¿ÖÐÄ£ÐÍÉúÎïµÄ½¨Á¢·Ç³£ÖØÒª¡£»ùÒòÇóý¼¼Êõ¾Í³£³£ÓÃÓÚ½¨Á¢Ä³ÖÖÌض¨»ùÒòȱʧµÄÉúÎïÄ£ÐÍ£¬´Ó¶ø½øÐÐÏà¹ØµÄÑо¿¡£ÕâЩģÐÍ¿ÉÒÔÊÇϸ°û£¬Ò²¿ÉÒÔÊÇÍêÕûµÄ¶¯Ö²Îï»ò΢ÉúÎï¸öÌå¡£×î³£¼ûµÄÊÇСÊ󣬼ÒÍá¢Öí¡¢Ï߳桢½ÍĸºÍÄâÄϽæµÈµÄ»ùÒòÇóýÄ£ÐÍÒ²³£¼ûÓÚ±¨µÀ¡£
¢Ú.¼²²¡µÄ·Ö×Ó»úÀíÑо¿ºÍ¼²²¡µÄ»ùÒòÖÎÁÆ¡£Í¨¹ý»ùÒòÇóý¼¼Êõ¿ÉÒÔÈ·¶¨Ìض¨»ùÒòµÄÐÔÖÊÒÔ¼°Ñо¿Ëü¶Ô»úÌåµÄÓ°Ïì¡£ÕâÎÞÂÛÊǶÔÁ˽⼲²¡µÄ¸ùÔ´»òÕßÊÇÑ°ÕÒ»ùÒòÖÎÁƵİÐÄ¿±ê¶¼ÓÐÖØ´óµÄÒâÒå¡£
¢Û.ÌṩÁ®¼ÛµÄÒìÖÖÒÆÖ²Æ÷¹Ù¡£ÖÚËùÖÜÖª£¬Æ÷¹ÙÀ´Ô´Ï¡ÉÙÍùÍùÊÇÈËÌåÆ÷¹ÙÒÆÖ²µÄÒ»´óÖÆÔ¼ÒòËØ£¬¶ø´óÁ¿Á®¼ÛµÄÒìÖÖÉúÎïÈçÖíµÈµÄÆ÷¹ÙÈ´²»ÄÜÓÃÓÚÈËÌå¡£ÕâÊÇÒòΪÒìÔ´ÉúÎïµÄ»ùÒò»á²úÉúһЩÄÜÒýÆðÈËÌåÇ¿ÁÒÃâÒßÅųâµÄÒìÔ´·Ö×Ó£¬Èç¹ûÄܽ«²úÉúÕâЩÒìÔ´·Ö×ӵĻùÒòÇóý£¬ÄÇô¶¯ÎïµÄÆ÷¹Ù½«ÄÜÓÃÓÚÈËÌåµÄ¼²²¡ÖÎÁÆ£¬Õ⽫Ϊ»¼Õß´øÀ´¾ß´óµÄ¸£Òô¡£È磺PPL Therapeutics ¹«Ë¾ÓÚ1999 ÄêÒѳɹ¦µØÔÚÖíµÄÌåϸ°ûÖÐÓûùÒòÇóý¼¼ÊõÇóýÁ˦Á-1£¬3GT »ùÒò¡£Ê¹Ã¿Ö»Öí¶¼È±·¦²úÉúa1-3°ëÈéÌÇ»ùתÒÆøµÄ»ùÒòµÄ2¸ö¿½±´¡£ÕâЩøÔÚϸ°û±íÃæ²úÉúÒ»ÖÖÌÇ·Ö×Ó£¬ÈËÌåµÄÃâÒßϵͳ¿ÉÒÔÁ¢¼´±æÈϳöÕâÖÖÌÇ·Ö×ÓΪÒìÔ´ÐÔ£¬´Ó¶øÒý·¢³¬¼±ÐÔÃâÒßÅųⷴӦ¡£ÔÚȱ·¦ÕâÖÖøµÄÇé¿öÏ£¬³¬¼±ÐÔÅųⷴӦ¼´²»»áÔÙ·¢Éú¡£
¢Ü.ÃâÒßѧÖеÄÓ¦Óá£Í¬ÒìÔ´Æ÷¹ÙÒÆÖ²ÏàËÆ£¬ÒìÔ´µÄ¿¹ÌåÓÃÓÚÈËÌåʱ»ò¶à»òÉÙ»áÓÐÒ»¶¨µÄÃâÒßÅų⣬ʹµÃÈËÓÿ¹ÌåÀàÒ©ÎïµÄÉú²úºÍÓ¦ÓÃÊÜ×è¡£¶øÈç¹û½«¶¯ÎïÃâÒß·Ö×Ó»ùÒòÇóý£¬»»ÒÔÈ˵ÄÏàÓ¦»ùÒò£¬ÄÇô½«²úÉúÈ˵Ŀ¹Ì壬´Ó¶ø½â¾öÈËÔ´¿¹ÌåµÄÉú²úÎÊÌâ¡£
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