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iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的制备及其靶向性研究
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作者：张婧、严飞、李莉，10.13286/i.cnki.chinhosppharmacyi.2016.08.02 摘要 目的:制备iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物,研究其靶向性 。方法:采用薄膜-超声分散法制备生物素化的 iRGD 靶向载药脂质体和生物素化的超声微泡 。利用生物素-亲和素系统(Biotin-avidin-system,BAS)连接脂质体与微泡,构建并表征iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物。细胞黏附实验验证复合物的体外靶向结合性能;构建小鼠乳腺癌移植瘤模型,通过靶组织的药物荧光强度验证复合物的体内靶向性 。结果:iRGD靶向载药脂质体的粒径为(165.07±4.01)nm,电位为( -12.92 ±0.26)mv,复合物的载药量为每108 个复合物载紫杉醇(46.22±1.95)以g;黏附实验表明靶向组复合物与血管内皮细胞结合数量明显多于非靶向组复合物(7.8±1.1,0.2±0.45,P<0.01);荷瘤小鼠活体成像实验显示靶向组复合物的肿瘤组织荧光明显强于非靶向组复合物 。结论:iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物,作为一种靶向给药系统,可以实现超声分子成像与超声给药的有机结合,显著提高药物靶向递送的效率。 乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,且我国女性乳腺癌的死亡率呈持续上升趋势[1]。紫杉醇是来源于红豆杉的一种细胞毒性物质 ,被广泛用于乳腺癌和卵巢癌的治疗[2]。然而普通抗肿瘤化疗药物无法实 现在肿瘤部位靶向聚集并渗透到肿瘤的内部 ,大大限 制了药物的疗效[3]。超声微泡爆破介导药物的靶向 传递已经成为一种新型的给药方法[4]。将超声微泡 作为药物载体 ,静脉注射超声微泡后 ,在靶组织区域 给予一定强度的超声辐照 ,超声微泡的空化效应 ,可 以扩大内皮细胞的间隙 ,使得血液中或微泡携带的药 物趁机进人细胞或顺利透过血管 ,从而增加药物在靶 组织的细胞摄取[5]。然而 ,现在广泛运用的微泡单层 壳膜载药能力有限 ,往往难以达到肿瘤治疗的有效剂 量 。脂质体作为一种良好的药物载体 ,具有保持药物 活性、增强药物溶解度、减少对正常组织作用等优 点[6]。将脂质体连接到微泡的表面获得脂质体-微泡 复合物 ,这种复合物具有脂质体高载药量的优势并保 存了微泡良好的声学性能 ,在提高载药量和超声控释 药物方面具有明显的优势[7]。iRGD是一种序列为 CRGDKGPDC的环状多肽 ,肿瘤新生血管内皮细胞 和大多数肿瘤细胞高表达整合素 aVβ3受体 ,iRGD 肽作为整合素 aVβ3受体的识别配体 ,能主动靶向识别高表达整合素 aVβ3受体的细胞;iRGD还具有穿 膜肽的作用 ,能够利用 NRP-1受体更好地引导药物 进人细胞内部 ,可大大提高细胞内的药物浓度[8]。 本实验将 iRGD连接到载药脂质体上 ,再通过 生物素-亲和素系统将脂质体连接到超声微泡的表 面 ,获得iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物 。利用 iRGD的靶向作用将载药脂质体-微泡复合物主动靶 向结合肿瘤新生血管 ,增加微泡在靶向组织的聚集 , 再通过超声爆破复合物 ,定点可控地在肿瘤部位释 放药物 ,释放的药物通过 iRGD进一步渗透到肿瘤 内部并明显提高局部组织的药物吸收。 1 材料与方法 1.1 材料 胆固醇 ,亲和素(美国 Sigma公司),二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)、聚乙二醇 2000-二硬脂酸磷酯酰乙醇胺 (DSPE-PEG2000)、生物素酞化聚乙二醇2000-二硬 脂酸磷酯酰乙醇胺(DSPE-PEG2000-Biotin)、马来 酰亚胺聚乙二醇 2000-二硬脂酸磷酯 酰 乙 醇 胺 (DSPE-PEG2000-MaIeimide)(美国 Avanti公司), iRGD多肽(CCRGDKGPDC-NH2 ,纯度 >98%  ,全氟丙烷(C3F8,天津核工业 理化研究院),紫杉醇(pacIitaxeI,上海紫试剂厂),香豆素 6(Coumarin6 ,上海 AIaddin公司), IR-780碘化物(美国 Sigma公司),SPF级雌性纯系 BALB/c小鼠(广东省动物中心 ,动物合格证号 11400700103055,使用单位许可证号 SYXK粤 2012-0119),4T1乳腺癌细胞、bEend.3小鼠血管内皮 细胞(美国模式菌种收集中心 ATCC)。AcuSi- zer780粒度仪(PSS公司),纳米粒度及电位分析仪 (MaIvern公司),Vevo2100超声实时分子影像系 统(加拿大 VisuaISonics公司),倒置荧光显微镜 (奥林巴斯公司),高效液相色谱仪(日本岛津公司), 小动物三维成像系统(CaIiper公司)。1.2 DSPE-PEG2000-iRGD的合成 按照摩尔比 (iRGD  SPE-PEG2000-maIeimide为 1:1)称量药 品 ,并分别溶于纯化水中 ,冰浴条件下搅拌反应 24h,反应液置透析袋(Mw3500)中 ,于去离子水中 透析 48 h 以除去游离的 iRGD,冷冻干燥后 ,于 -20℃保存。1.3 iRGD靶向载药脂质体的制备 精密称取一 定比例的 DPPC、胆固醇、DSPE-PEG2000-Biotin、DSPE-PEG2000-iRGD、紫杉醇或香豆素 6 或 IR- 780,将以上材料溶解于三氯甲烷中 ,通过氮气吹干 有机溶剂 ,并真空干燥处理 3 h。在干燥脂质膜中 加人磷酸盐缓冲液(pH=7.4)溶液后 ,于 60℃水浴 超声清洗仪内超声至脂质溶液澄清 。用同样的方法 制备非靶向载药脂质体作为对照 ,其中用等量的 DSPE-PEG2000替代 DSPE-PEG2000-iRGD。取适量非靶向载药脂质体(ControI-Iiposome)和 iRGD 靶向载药脂质体(iRGD-Iiposome),分别利用纳米粒 度及电位分析仪测定粒径及 Zeta电位 。采用低速- 高速离心相结合法[9]测定脂质体的包封率。 1.4 生物素化微泡的制备 生物素化微泡造影剂 的制备参照文献[10]。将 DSPC、DSPE-PEG2000、 DSPE-PEG2000-Biotin(摩尔比90:5:5)溶解于三氯 甲烷中 ,在涡旋混合器上混匀后通人干燥的氮气吹干 ,在试管壁上形成均匀的薄膜后真空干燥 3 h,以 完全除尽残余三氯甲烷 。加人pH 7.4的缓冲液 (Tris、甘油、1,2-丙二醇体积比为 8:1:1)。置于 60 ℃水浴超声清洗仪内超声 ,直到得到透明的脂质溶 液 。分装人西林瓶中 ,加盖密封 ,将瓶中的空气置换 成 C3F8气体 。用机械振荡仪振荡 45s,即完成生物 素化微泡造影剂的制备。 1.5 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的制备 将制备好的生物素化微泡以用磷酸盐缓冲液(PBS pH=7.4)洗涤 3次 ,400xg离心3min。取过量亲 和素溶液与生物素化微泡室温孵育 30min,借助离 心漂浮法用 PBS洗涤纯化 ,洗去多余的亲和素 。将 "1.3,项下制备好的脂质体与上述溶液室温孵育 30 min,即得到 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物。非靶向载药脂质体采用同样的方法与生物素化微泡 连接获得非靶向载药脂质体-微泡复合物作为对照 用于后续的实验。 1.6 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的表征 1.6.1 复合物的粒径分布 将制备好的 iRGD靶 向载药脂质体-微泡复合物(iRGD-Iipo-MBs)用纯化 水稀释 ,取 10以L复合物混悬液于 AcuSizer780A 粒度仪测得粒径大小及浓度 ,系统设置粒径下限值 为0.5 以m。 1.6.2 复合物的形态观察 香豆素 6作为模型药 物 ,将iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物用纯化水 稀释至 1x107/mL(粒度仪测得复合物数量),取 2 滴于载玻片上 ,盖上盖玻片 ,于倒置荧光显微镜下观 察。 1.6.3 复合物的超声显像 取200以L微泡数量为 1x 106/mL 的复合物于琼脂模型中 ,采用 Vevo 2100超声实时分子影像系统观察其成像效果。 1.6.4 复合物的载药量测定 取 1 mL微泡数量 为 1x108/mL的复合物烘干后加人三氯甲烷溶解 破坏双层脂质并释放脂质体内容物 ,将三氯甲烷挥 发后加人甲醇 1 mL待测高效液相色谱(HPLC)。高效液相色谱条件根据文献中的实验条件[9]。色谱 柱 C18柱(250mmx4.6 mm,5 以m);流动相:乙腈-水(50:50);流速为1.0mL·min-1 ,进样量20以L,检 测波长 227nm,柱温为室温。 1.7 细胞培养及iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的特异性黏附实验 采用 DMEM 高糖培养基 (含 10%胎牛血清和 1%青霉素-链霉素溶液)培养 小鼠乳腺癌细胞(4T1)和小鼠血管内皮细胞(bEnd. 3)。取对数生长期的小鼠血管内皮细胞 5x 104个/ 孔接种于24孔板中 ,置于 37℃、5% CO2培养箱中 继续培养 24h。然后分别将 200以L微泡数量为 1 x107/mL的香豆素靶向复合物混悬液和香豆素非 靶向复合物混悬液加人到 24孔板中 ,将细胞培养板 密封 ,倒置使复合物与细胞表面充分接触 ,轻轻晃动 培养板 ,室温孵育 5 min后用 PBS冲洗去除游离的 复合物 ,于倒置荧光显微镜下观察后进行超声释放药物 。2组分别随机选取 5个不同视野 ,对与细胞 结合的复合物进行计数。 1.8 小鼠乳腺癌移植瘤模型的构建及活体成像实验 取体质量 18~2g的雌性 BALB/c小鼠 ,于背部靠 近右后肢处接种 4T1细胞 ,7 d后出现米粒大肿瘤证 实接种成功 。将荷瘤小鼠随机分为 2组(iRGD-Iipo- MBs,ControI-Iipo-MBs),每组 6 只 ,剃除毛发 ,按0.2 mg·kg-1剂量于尾静脉注射"1.5,项下制备的 IR-780 靶向载药脂质体-微泡复合物和IR-780非靶向载药脂 质体-微泡复合物 ,待复合物在靶组织聚集 5 min后 , 在肿瘤部位超声 60 s(频率 = 1 MHz,强度 = 1.0 MPa,PRF=1 Hz,占空比 = 1%),0.5 h和 12h后分 别置于近红外活体成像下观察。 1.9 数据分析 采用 SPSS19.0进行数据分析 ,计 量数据用 ±s表示 ,两组间比较采用独立样本t检 验 ,以 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 自制 iRGD靶向载药脂质体的粒径、Zeta电 位及包封率 由纳米粒度及电位分析仪测得制备的 iRGD靶向载药脂质体平均粒径在 200nm以下 ,多 分散性良好 ,Zeta电位为负值 ,包封率在 80%以上 , 制备重复性良好(表 1)。 图片 2.2 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的表征 2.2.1 粒径分布 由 AcuSizer780A粒度仪测量 结果显示 ,iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物粒径为(1.80±0.26)以m(图 1A)。 图片 2.2.2 一般特征及形态 iRGD靶向载药脂质体- 微泡复合物的示意图如图 1B所示 。复合物外观呈 乳白色混悬液,在光镜下观察,复合物呈规整球形, 大小分布均匀,形态与普通微泡相同,分散度好,未见明显粘连或聚集成团现象(图 1C)。使用香豆素 6为模型药物,荧光显微镜下可明显观察到脂质体 与微泡连接的状态 。微泡壁因连接脂质体而不光 滑,周围可见数量不等的绿色点状香豆素6脂质体 。 2.2.3 体外超声显影特征 Vevo2100超声成像探头下琼脂孔内的 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合 物回声较为均匀,与 PBS相比,显示出良好的超声 造影效果(图 1D)。 2.2.4 载药量 采用标准曲线法测定紫杉醇的浓度。紫杉醇在0.5~80以g.mL-1范围内与峰面积呈 良好的线性关系,以峰面积 A 对质量浓度C(以g. mL-1)进行线性回归,得标准曲线方程为:A=25554.79C-4 866.65,r2 =0.999。测得复合物的载药量为每 108个复合物载紫杉醇(46.22± 1.95) 以g。 2.3 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物的特异性黏附 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物与细胞的 黏附情况于光学显微镜和荧光显微镜下观察,非靶向载药脂质体-微泡复合物组,细胞表面未见复合物 黏附;靶向载药脂质体-微泡复合物组,细胞表面可 见大量复合物黏附且十分牢固,经 PBS反复洗涤 3 次未见脱落 。未进行超声辐照时,复合物以微泡形 式黏附在细胞上且个数较多,说明复合物能够与细 胞表面整合素受体 aVβ3结合;超声辐照后微泡被 击破,药物从微泡表面释放出来(图 2)。 图片 光学显微镜下观察,靶向组平均每个细胞有 (7.8± 1.1 )个复合物黏附,非靶向组平均每个细胞 有(0.2±0.45)个复合物黏附,靶向组与非靶向组复 合物结合数量比较,差异有统计学意义(图 3)(P<0.01)。 图片 2.4 体内活体成像 荷瘤小鼠活体成像实验结果 显示:iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物组的荷瘤 小鼠肿瘤组织荧光明显强于非靶向载药脂质体-微 泡复合物组(图 4)。 图片 3 讨论 药物递送系统治疗肿瘤如乳腺癌仍面临许多的挑战 。高效率和有针对性地输送抗肿瘤药物进人肿 瘤组织中 ,使药物定点和控制释放 ,提高药物的生物 利用度和细胞摄取是目前研究的热点 。KIibanov 等[11]的研究表明脂质体-微泡复合物这种声敏药物 载体对脂溶性药物和水溶性药物均有较高的载药 量 ,可满足临床肿瘤治疗的用量需求 。 Lentacker 等[12]利用该复合物载体包裹阿霉素在体外实验验 证了载阿霉素的脂质体-微泡复合物联合超声对黑 素瘤细胞的杀伤力显著增强 。Yon等[13]应用该复 合物载体将抗肿瘤药物和基因特定传输至肿瘤部 位 ,以增强治疗效果 ,证明了脂质体-微泡复合物在 体内治疗肿瘤的临床意义 。 同时由 iRGD修饰的主 动靶向载药脂质体 ,在肿瘤治疗方面也有一定的应 用前景[14-15]。 目前 ,超声微泡已广泛用于临床及实验 ,并且取 得了令人瞩目的成果[16]。然而 ,脂质体-微泡复合 物在应用方面仍有较多局限性:脂质体-微泡复合物 的制备方式较为复杂 ,需要多次的离心洗涤;亲和 素-生物素的免疫原性导致这种材料应用于临床并 不理想 。 因此 ,脂质体-微泡复合物这一研究领域需 要进一步开发与改进。 本实验采用生物素-亲和素非共价键结合方式 制备获得了超声性能好、载药量高且具有靶向性能 的 iRGD靶向载药脂质体-微泡复合物 ,并且通过体 外寻靶实验证明 ,iRGD靶向载药脂质体-微泡复合 物能够主动结合到细胞表面 ,而且结合牢固;荷瘤小鼠活体成像图直观地证明了 iRGD修饰的复合物提 高了给药系统的肿瘤靶向性。 综上 ,复合物的表征测定和寻靶能力的观察研 究 ,为脂质体的载药性能、超声联合微泡的声孔效应 以及靶向治疗三种治疗策略结合运用到乳腺癌的治 疗上提供了实验依据 ,为肿瘤的靶向特异性治疗提供了广阔的应用前景。 |
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