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菁染料Cy7|Cy5|Cy5.5|Cy3荧光标记介绍
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1、综述： Cy (Cyanine)系列,也叫菁染料，即花青素系列荧光染料是具有多聚次甲基桥链化学结构特点的一类合成荧光染料。Cy染料的次甲基桥链（1-7个次甲基）两端常常连着两个氮原子，其中一个氮原子带正电，从而Cy染料形成具有离域正电荷效应的介离子化合物。因为这个结构特点，Cy染料的消光系数（extinction coefficient）非常高。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值，从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。桥链长度和两端的发色团直接控制着染料的吸收峰和发射峰值，从而让Cy系列染料可以覆盖从紫外到远红外的几乎所有常用荧光谱带。菁染料Cy系列常分为脂溶性Cy染料、水溶性Cy染料。 青色素这一类荧光染料相对较少。它从青色素衍生而来，也是其名称的由来：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通过其反应基团与核酸，多肽和蛋白相连。其中，Cy3 and Cy5 是高消光系数的染料。特别适用于细胞内敏感的多肽定位实验，也是常用的多肽标记染料之一。关于青色素这类荧光，Cy5还因为对其周边电子环境特别敏感，该特征可用于酶测定。附着蛋白质的构象改变会导致荧光发射产生阳性或阴性变化。此外，Cy3和Cy5还可用于FRET试验。 图片 由于细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小，因此在检测复杂生物系统时，近红外染料能提供更高的特异性和灵敏度。同时，由于光波在近红外区段的组织透过性更好。菁染料的摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的，Cy7 NHS ester, Cy5.5 amine 和Cy3 azide 的吸收在近红外区背景非常低，是荧光强度最高、最稳定的长波长染料。特别适合于活体小动物体内成像代替放射性元素。 2、脂溶性Cy染料 脂溶性Cy染料包括Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy7和Cy7.5，其中Cy3，Cy5和Cy7的发色团是indolenine，而Cy3.5，Cy5.5和Cy7.5的是Benzoindole。Benzoindole仅仅比indolenine多了个苯环，这多余的一个苯环让整个染料吸收峰和发射峰红移，从而让Cy染料系列覆盖广泛的荧光谱图。Cy染料的结构几乎是对称的，为了让染料可标记，这其中的一个发色团上引伸出一个6碳链羧基来活化标记。 虽带一个正电荷，脂溶性Cy染料的水溶性也比较低。在标记生物分子时（一般在缓冲溶液中），常常需要加入有机溶液（一般5-20%的DMF或者DMSO）助溶。常规是将染料先溶于有机溶剂中，然后按比例加入到生物分子的水溶液中反应，反应完成后离心除去沉淀的染料。当然脂溶性Cy染料也可以直接在有机溶剂中直接与有机小分子反应，标记小分子或者高分子材料。脂溶性Cy染料也易溶于氯仿，甲醇，THF，乙腈等常规有机溶剂。 3、水溶性Cy染料： 水溶性Cy染料是在脂溶性Cy染料的发色团上加入磺酸基团从而大大增加了染料的水溶性，同时还稍微提高了染料的光学稳定性和量子产率，因此水溶性染料更耐受光照，发出的荧光也稍强一些。 由于磺酸盐的原因，这类染料的水溶性非常高，在标记反应中不需要加入任何有机溶剂助溶，另外标记上去的染料分子由于水溶性好不会聚集，也不会影响被标记大分子的稳定。这点非常重要，特别是当每个目标生物大分子上需要标记多个染料分子，或者目标生物大分子溶解度低，稳定性差时。 4、Cy3 (Cyanine 3) 是一种发橘黄色荧光的花青素荧光染料。Cy3染料的激发峰和发射峰分别在550 nm和570 nm左右，它的荧光肉眼观察很明亮，并且对pH不敏感，在共聚焦显微镜中可以用532nm（肩峰）或者556nm（顶峰）的激光束激发，在普通荧光显微镜中可以用 TRITC (tetramethylrhodamine) 的滤片观察，所以在大部分荧光仪器上都可以使用。 5、Cy7 (Sulfo-Cyanine7) Cy7是一种荧光标记试剂 (Ex=750 nm，Em=773 nm)。Cy7 (Cyanine 7) 是一种近红外花青素荧光染料，磺化Cy7(Sulfo-Cy7)是它的水溶型，常常统称为Cy7。由于它的荧光波长(em：~770 nm)恰好处于肌体近红外窗口 I 的区域(肌体的血液，体液和在此区域背景荧光弱，并且长波长光子的穿透性较强)，所以Cy7常常应用于小动物活体体内成像中。Cy7荧光肉眼不可见，所以在显微镜头下观察时需要借助CCD相机在成像软件中显示。另外近红外滤片较少见，很多荧光显微镜(包括共聚焦显微镜)并不配备，但是流式细胞仪(flow cytometry)常常配备有Cy7滤片组，IVIS等小动物成像系统、Odyssey近红外荧光扫描仪等设备也配备有。Cy7是常用荧光染料，Cy7可以用来标记核酸，蛋白，抗体，多肽，纳米粒等，它是常见的小动物显影剂之一。 Cy7荧光基(fluorophore)是长链多次甲基结构。目前也有一些结构优化的Cy7染料，比如利用环己烯固化多次甲基桥链(polymethine)，据称可荧光量子产率20%，但是这一结论目前还存在争论(Dyes and Pigments, 2013, 99, 275-283)，可能并没有荧光增果。无论是哪种结构，Cy7及它的衍生物Cy7.5的量子产率都较低，一般都<0.1左右。量子产率偏低是近红外染料(包括近红外荧光蛋白)的通病，并且染料波长越长，量子产率越低，比如很多近红外窗口II染料的量子产率都低于0.01。 普通Cy7的水溶性较低，所以在水相的标记反应体系内需要使用有机共溶剂，常用有机溶剂包括DMF，DMSO和乙腈等。如需标记的分子对有机溶剂敏感，可选择磺化Cy7。两者的光谱性质几乎一致，因此大部分应用可相互替换。磺化Cy7水溶性好，可在水相标记反应体系中直接使用，不需要有机溶剂助溶，适合标记对有机溶剂敏感的生物分子。另外由于强水溶性加染料分子本身带电荷，磺化Cy7标记到生物分子表面后不会引发疏水性聚集，荧光标记产物的稳定性。 6、特点 CY花菁染料的优点： 1：菁染料的摩尔吸光系数在荧光染料中是最高的 2：细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小 3：更高的特异性和灵敏度 4：光波在近红外区段的组织透过性更好 5：染料细胞毒性小 可用于标记抗体 蛋白 细胞。因此CY花菁染料是非常适合做小鼠活体成像的荧光染料 CY花菁染料的缺点： 1：菁染料的荧光量子效率相比其他染料较低，一般是0.1-0.2 2：多川结构的菁染料容易发生聚集 7、总结 多肽荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛，多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时，这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。 人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激 酶、磷酸酶、肽酶等）。 |
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