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ZMQ68

新虫 (初入文坛)

[交流] EMSA!!!已有4人参与

最近做EMSA,EB染色后DNA片段一直看不到。想请教有经验的前辈一些问题!!!!!

启动子必须加探针标记吗???很无知无助无力了。。我现在只用了纯化后的启动子片段跟蛋白孵育后跑Native-PAGE,用考马斯染蛋白有正确条带,很正常。
但是用EB染色20min紫外照胶却看不到DNA条带,不知道什么原因。是不是DNA浓度低,有没有做相关的实验,能否告知一下您的实验条件参考一下,,不胜感激!!!!!

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pennchem

专家顾问 (正式写手)


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(1) 探针的浓度够吗? (单独跑探针染色能染上吗)
(2) 探针的大小(是否太大,没有进入分离胶;是否太小,已经跑出去了?)
(3) 探针与蛋白结合的条件是否有利于结合(镁离子是否必须,盐离子浓度超过100mM了吗? 缓冲液的pH值是多少?)
(4) 在(3)的条件下,探针是否与蛋白结合(有实验证据吗)
(5) 是否有可能存在探针被降解的可能?
(6) 电泳过程是否大量产热,是否导致蛋白变性,或者复合物解离?
(7) 一步步做对照试验吧,一个实验不成功,很难说明哪(几)个步骤有问题

good luck~
行至水穷处,坐看云起时
2楼2022-08-04 17:43:41
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jinvijie

铁虫 (著名写手)


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我也好奇启动子不标记是否可以检测出来

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找博导:硕士肿瘤药理学-分子生物学方向,六级已过,口语达到能表达自己,SCI二区。
3楼2022-08-05 00:24:08
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xuxinH

新虫 (初入文坛)


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要加标记的探针吧

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4楼2022-08-05 00:57:56
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armigera

金虫 (正式写手)


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DNA探针浓度太低,EB不可能染出来。要标记

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5楼2022-08-05 05:29:10
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ZMQ68

新虫 (初入文坛)

6楼2022-08-05 15:59:17
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ZMQ68

新虫 (初入文坛)

谢谢回帖!!      1.用跑native-page胶制备的体系剩下的混合物跑了一次琼脂糖凝胶电泳(DNA经过比例稀释),出现了很浅的一条带。后续有重新进行扩增、产物纯化鉴定,目前不确定不加标记的探针我采取得浓度一系列操作下来染色是否可行。此外,在跑非变性胶做对照时,只有探针的胶孔染色也是看不见。    2.我采用的是连续体系,探针大小约250+bp或350bp,我单独染蛋白位置大约在蛋白胶的1/3处,溴酚蓝指示剂约在底部1/5处,按道理应该没有跑出去。电压100V,约两小时。    3.结合条件,参照文献设定,实验过程中没有涉及到镁离子,盐浓度设置为50mM,缓冲液PH8。    4.参照文献探针与蛋白应该有结合,由于一直没有染出DNA条带,因此不确定是实验方法问题,还是操作等问题。     5.DNA探针均为新制备,长时间可能会被降解,目前可能性较低。    6.电泳过程持续在4度下进行,蛋白染色发现并没有变性。7.非常感谢提出地注意事项!!!顺便问一下DNA探针如果不标记是否能做出来?标记是必须的吗?

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7楼2022-08-05 16:13:41
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ZMQ68

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by armigera at 2022-08-05 05:29:10
DNA探针浓度太低,EB不可能染出来。要标记

请问你DNA探针不标记尝试过吗?如果浓度足够高,不标记是否可行?期待回帖!

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8楼2022-08-05 16:14:50
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armigera

金虫 (正式写手)


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引用回帖:
8楼: originally posted by zmq68 at 2022-08-05 16:14:50
请问你dna探针不标记尝试过吗?如果浓度足够高,不标记是否可行?期待回帖!
...

根据我曾经的经验,自由探针(未结合蛋白)是大多数, 结合的只是少数。所以你能看到总的dna并不能代表能看到结合的条带。以上是我的推测,欢迎一起讨论。
我之前用同位素标记的,没有做过未标记直接染色的。

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9楼2022-08-05 21:38:35
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