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4.高通量测序（NGS）——文库构建疑难问题解读
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4.1. Q: 建库接头添加量如何计算？ A: 公式：Input DNA 摩尔数（pmol）≈ Input DNA 质量(ng)/ [0.66 × Input DNA 平均长度（bp）]。 举例：Input DNA 100ng，长度 300bp，那么接头应该添加多少？ 根据公式，计算 Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5pmol 根据接头添加比例 100:1，接头摩尔比 = 100×0.5=50pmol 接头添加量=接头摩尔比（50pmol）÷接头浓度（15μmol/L）=3.34μL 备注： 15μmol/L=15pmol/μLa 4.2. Q: 磁珠回收率低是怎么回事？ A: 1） 峰形问题，回收的峰窄时，计算所得回收率低，不影响测序。 2） 操作问题，孵育时间不足。保证孵育时间在 5min，长片段可孵育 10min。 3） 操作问题，第二轮移器上清时吸到磁珠。如做分选，可在 200μL 枪头前串联 10μL 枪 头用于移液，可防止吸到磁珠。 4） 操作问题，磁珠使用比例不对。如做分选，应使用说明书中推荐的磁珠比例。 5） 操作问题，洗涤时用的乙醇浓度低。使用新鲜配制的乙醇，浓度至少在 70%以上。 6） 操作问题，干燥过度。洗脱前，如果磁珠干燥过度，会使 DNA 紧紧吸附于磁珠上，不 易洗脱。防止过度干燥，观察磁珠表面无液体至刚刚出现龟裂即可。 7） 操作问题，洗脱液体积不足。水应完全覆盖磁珠。 8） 操作问题，磁珠与 DNA 混匀不充分。保证充分混匀，充分吸附。 4.3. Q: 磁珠可以吸附单链 DNA 和 RNA 吗？ A: 1） 可以回收单链 DNA。附件是 Beckman 磁珠回收单链 DNA 的数据，可以作为参考。 因为我们的三类 DNA 磁珠主要定位于双链如 PCR 或者文库产物等，所以我们没有具体测 试过单链 DNA 的回收情况，客户可以自行试验一下。 2）不建议用于回收 RNA。三类 DNA 磁珠并不是 RNase-free 磁珠，所以回收单链 RNA 可 能会发生降解。如果需要回收 RNA，建议使用我们的 RNA Cleaner 磁珠。 4.4. Q: Cat#12601 磁珠可以纯化基因组 DNA 吗？ A: 12601 我们测试过最大 20kb 的片段，回收率>90%。基因组 DNA 未测试过，测试时， 由于大的 DNA 与磁珠结合的非常紧，所以应尽量增加洗脱液体积，避免干燥时间过久。 Q: 12601 磁珠的回收率？ A: 对于 200bp 以上的 DNA 片段，回收率在 90%以上；对于 200bp 以下的 DNA 片段， 回收率在 50%左右。 小插播 珠海宝锐生物科技有限公司-专注于核酸诊断试剂核心原料领域提供优质，可定制化服务 【品类齐全的热启动酶，MMLV逆转录酶，Tth酶，各式预混液，核酸提取试剂【磁珠法，实际操作v10min】，恒温LAMP，温敏UNG，全系列可冻干（已拿NMPA三类批件），自研发科研仪器】 【有需要的老师公司可以申请免费测试小样，省级专精特新企业，质量可媲美进口，谁试谁知道】 【有自己的研发中心，可以配合调整客户的项目进展】 【热烈欢迎登门拜访和莅临我司指导工作】Tel同V：13928097934 李先生 |
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