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常用的核酸染料种类对比，一文讲透核酸染料！
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核酸染料在生物实验中是不可或缺的一分子，尤其是在核酸检测相关试验中，所以核酸染料对于分子生物学相关专业的学生来说并不陌生，虽然核酸染料是在生物试验中经常用到的，但对于核酸染料的特性、适用范围、稳定性以及性价比等，我们又了解多少呢？下面就针对核酸染料的种类和和评价简单说一下。 No.1 常见核酸染料的种类 目前国内科研实验常以EB、SYBR、Gold View和Gel Red这几种类型的核酸染料为主。 01 Ethidium Bromide（EB，溴化乙锭） 在研究数以千计的实验室残留性有毒物质，最值得一提的就是溴化乙锭（EB；3, 8-二氨基-5-乙基-6-phenylphenanthridinium甲基溴），该物质的潜在的毒性作用已被大众广泛的认知。EB属于核酸分子嵌入剂，通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中，特别是国内实验室都在使用EB进行凝胶核酸电泳实验的染色。 EB是应用较早的核酸着色物质，本身在紫外照射下不发光（或发光很微弱），但它能与单链或双链DNA高效结合，结合后的复合物在紫外照射下（300 nm左右）会发出明亮的橙红色荧光，从而便于观察。因其便宜、灵敏度高且操作方便等特点，一直作为琼脂糖核酸电泳最常用的荧光染料。 但随着人们对EB特性认识的深入，了解到EB具有非常明显的毒性及诱导遗传物质（DNA）突变（致癌）的特性，导致现在很多人对其敬而远之，后续也就随之出现了多种以安全性为主打的无毒/低毒的核酸染料，俗称EB替代染料。 02 SYBR系染料 SYBR系列以Invitrogen品牌（现属于Thermo Fisher旗下）最为出名，SYBR系核酸染料自推出以来，因其灵敏度和安全性而大受欢迎，成为该品牌的明星产品之一。耳熟能详的SYBR Green I 荧光染料，SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm，是最早应用于核酸检测方面的EB替代染料。 不同种类的SYBR系核酸染料有不同的特点，如SYBR Green I 主要结合DNA，而SYBR Green II 主要结合RNA；SYBR Gold在灵敏度上有明显的优势；而SYBR Safe在安全性上则更胜一筹。 03 Gel Red系染料 GelRed是一种灵敏、稳定和相对安全的荧光核酸染色试剂。它可以替代高毒性染色剂－溴化乙锭（EB），用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中dsDNA和ssDNA的染色。GelRed的灵敏度远高于EB，并且不需要脱色。由于GelRed和EB有相同的光谱特性，因此用它替代EB时不需要更换成像系统。 GelRed既可用于预制凝胶也可用于电泳后染色。通常电泳后染色的灵敏度更高，并能排除染料对DNA迁移的干扰。使用GelRed进行电泳后染色，操作简单不需要脱色和特殊溶液。只要将染料稀释在0.1M NaCl中，并将凝胶置于染色液中，30分钟后就可以观察。染色液在室温下极为稳定，可以多次反复使用。相比而言，预制凝胶由于不需要额外染色过程，因此染料用量更少，更为简单经济。 04 GoldView系染料 GoldView系染料是在国内市场比较流行的一类染料，由于产品宣称低毒，且价格相对便宜，受到了国内一部分老师和同学的青睐。 Goldview是一种可代替溴化乙锭(EB)的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，Goldview与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。 No.2 核酸染料的评价 核酸染料目前已经有很多种类型，我们在做实验进行选择的时候，有哪些因素制约着我们呢，我们应该用哪些指标去评价它们，最终找到适合的染料呢？下面从安全性、灵敏度、稳定性、对染色效果的影响（比如染色方法、迁移率等）以及价格等方面来对染料进行评价。 01 安全性 如果选择EB替代染料，那么染料的安全性就是一个非常重要的指标。安全性评估主要的检测有Ames测试、细胞渗透性实验、染色体畸变和正向突变分析、口服毒性分析等。在安全性方面，具有较多检测项目和相对权威的机构出具检测报告的核酸染料，安全性可能会更高；另外在一些报道或对比数据中，我们也可根据它们可能的原料来判断它们的安全性。 02 灵敏度 几乎所有的EB替代染料都宣称其染料的灵敏度至少不低于EB，甚至高于EB，具体到试验内容上，只要不是有特殊的需求（需要极高的灵敏度），一般都能满足。 03 稳定性 核酸染料的稳定性和在各种条件下的染色效果，会直接影响观察到的染色结果。比如，Invitrogen的专家发现pH会明显影响SYBR系染色效率，如果它高于8.3或低于7.5，它的检测灵敏度显著下降。这种情况很容易被忽视，就如常见的Tris缓冲液的pH值会随着温度的变化而变化。 04 迁移率 在介绍迁移率之前，先了解下常用的核酸染料电泳中应用的3种方式。 （1）点染法：是指将核酸染料、样品和上样缓冲液混在一起，直接在胶上点样； （2）胶染法：是指在将融胶倒入胶板前，把核酸染料加入融化的琼脂糖凝胶溶液中混匀，然后再倒入胶板，这种方法也是最常用的方法；（3）泡染法：是指在电泳时不加入任何染料，在电泳完成后，将胶置入含有一定浓度核酸染料的染液中进行染色。 由于所有的核酸染料最终都会结合到DNA上，才能通过染料从而对DNA进行分析，这也就意味着如果采用点染法或胶染法进行核酸检测时，根据使用的染料不同，核酸染料或多或少会对核酸的迁移率甚至带型产生影响。一般来说，核酸染料分子越大，安全性会越高；但同时，用胶染法对电泳的迁移率或带型影响就越明显，虽然可以通过减少核酸上样量等方式来进行改善，但仍达不到泡染法的效果。这也是为什么大多数核酸染料（低毒/无毒）厂商建议，采用泡染法来得到准确、漂亮的核酸带型。 当然，对带型、迁移率等的影响除了核酸染料外，还有其它的影响因素，比如琼脂糖的质量，电泳缓冲液的缓冲能力等都有可能对带型和迁移率产生影响。 |
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