| 查看: 1224 | 回复: 1 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者wilsonismal将赠送您 10 个金币 | ||
[求助]
质粒构建过程中，载体上基因大量丢失
|
||
|
各位大佬们，我想将潮霉素抗性基因（1400 bp）连接到一个具有氨苄抗性的载体上（6000 bp） 我是先将载体通过XbaI-HindIII双酶切，切除一个900 bp左右的片段，进行线性化，并通过胶回收进行回收，回收的线性化载体（5000 bp），测序后结果符合预期 潮霉素基因通过PCR进行扩增，扩增后通过消化和PCR回收进行纯化，测序后结果也符合预期 潮霉素基因和线性化的片段分别使用T4 和同源重组进行连接，并分别转化入BL21，Trans10和JM109感受态，并使用有潮霉素和氨苄的抗性平板进行筛选 12小时后，挑取单菌落进行菌落PCR（引物位置在潮霉素基因上），结果呈阳性 挑取阳性菌在含有潮霉素和氨苄的液体LB培养基后培养12小时，提取质粒，并进行sanger测序（测序引物在潮霉素基因两端载体上），结果测序失败，然后使用氨苄通用引物对质粒进行测通，发现质粒长度仅有3900 bp，与预期中连接后6500 bp不符，经比对后发现，质粒中仅保留了质粒的Ori，氨苄抗性（AmpR）和潮霉素抗性（Hygr）区域，其他地方都没了 请问有人遇见过这种问题吗，怎么解决啊 |
回复此楼» 猜你喜欢
高斯计算参数设置
已经有1人回复
-
武汉轻工大学2024年化环学院机械力化学课题组硕士招生
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有118人回复
-
负载率计算
已经有0人回复
-
球磨纳米粒子条件
已经有6人回复
-
球磨分散剂
已经有3人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
snoopyzxx
木虫 (著名写手)
- MolEPI: 4
- 应助: 49 (小学生)
- 金币: 4687.6
- 散金: 1266
- 红花: 42
- 帖子: 2245
- 在线: 274.7小时
- 虫号: 548497
- 注册: 2008-04-19
- 性别: MM
- 专业: 全球变化生态学
2楼2021-04-18 14:30:08
30