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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？
【调剂】北京石油化工学院2024年16个专业接受调剂
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助，毕赤酵母系统表达阿魏酸酯酶，蛋白没有活性，可能哪些问题，该怎么解决现状？已有1人参与

本人初入分子生物，用PPIZCA质粒重组了阿魏酸酯酶的基因序列，然后我把重组质粒导入毕赤酵母中。结果是，PCR和测序验证基因大小和序列没问题，western blot也做了能看到所在处清晰的条带，但是有一次出现了包涵体，这一次没有，我用这一次的粗酶液和提纯的蛋白测试酶活性，结果一点活性没有。请教大佬帮我分析一下可能的原因和解决办法。

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1楼2021-03-28 08:03:44
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forhighbio

捐助贵宾 (著名写手)
基因序列没问题吧，如果是专利里面拷贝的序列，可要担心呢

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2楼2021-03-28 11:07:24
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提纯蛋白是包涵体纯化出来的还是可溶纯化出来的？
如果是包涵体纯化的话，有时候虽然能纯化出来可以溶解，但是其实是不正确折叠的没有活性
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
3楼2021-03-28 12:48:27
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
酵母表达怎么会出现包涵体呢？概率极低。

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4楼2021-03-28 22:42:20
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
你这个载体是胞内表达啊，破菌纯化的？

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5楼2021-03-28 22:43:01
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-03-28 22:43:01
你这个载体是胞内表达啊，破菌纯化的？

嗯嗯，我的是胞内表达，用的200w，10s超声，10s停止，一共20min的超声条件，加了ripa和pi，我这个是水解酶，不知道是我在提的过程中失活了。对了，我的粗酶液酶活检测，是我50毫升培养液取了100微升的上清做的活性检测，这个量是有些少了吗？一般需要富集粗酶液吗？

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6楼2021-03-30 14:18:56
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-03-28 22:42:20
酵母表达怎么会出现包涵体呢？概率极低。

嗯嗯，老师告诉我会不会是胞内有抑制活性的，你知道假如胞内有抑制酶活的物质，该如何避免呢，加什么东西吗？

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7楼2021-03-30 14:21:03
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by forhighbio at 2021-03-28 11:07:24
基因序列没问题吧，如果是专利里面拷贝的序列，可要担心呢

进行PCR得到的基因序列没有问题，还要检查什么东西吗？

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8楼2021-03-30 14:21:59
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Ma丶lone

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2021-03-28 12:48:27
提纯蛋白是包涵体纯化出来的还是可溶纯化出来的？
如果是包涵体纯化的话，有时候虽然能纯化出来可以溶解，但是其实是不正确折叠的没有活性

可溶提纯的，我有histag标签我用的亲和层析法提纯的。我的基因序列对，电泳分子大小也对，蛋白条带也对，就是酶活没有。这个你碰到过吗？还是我酶活检测的样品太少了吗？或者中间被我弄失活了？

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9楼2021-03-30 14:24:29
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Ma丶lone at 2021-03-30 14:18:56
嗯嗯，我的是胞内表达，用的200w，10s超声，10s停止，一共20min的超声条件，加了ripa和pi，我这个是水解酶，不知道是我在提的过程中失活了。对了，我的粗酶液酶活检测，是我50毫升培养液取了100微升的上清做的活性 ...

没看懂。粗酶液是破菌后取得上清测得，还是发酵液上清？

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10楼2021-03-30 20:02:07
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